流式細(xì)胞術(shù)工作原理是在細(xì)胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析。它可以高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)代Z先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一。

有非常多種類的樣本被用于流式分析，像皮膚、骨sui穿刺液、組織活檢物、漿膜腔積液、外周血、腦脊液、骨sui活檢物、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物）、細(xì)針穿刺物等。免疫表型分析質(zhì)控Z困難的步驟之一可能就是是樣本的條件控制。不同的樣本在采集、保存、運(yùn)輸和制備方面都有不同的要求。所以Zxian需要觀測樣本的外觀：如果有嚴(yán)重溶血、凝聚或壞死的樣本應(yīng)該果斷棄用。

單細(xì)胞懸液的獲取：

外周血和骨sui穿刺液是天然的單細(xì)胞懸液；活檢組織常用機(jī)械分離和酶消化兩種方法。不同的實(shí)驗(yàn)需要選擇不同的方法。對于需要進(jìn)行膜抗原標(biāo)記的，不僅要獲得足夠多的單細(xì)胞懸液，還要盡量保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性，選擇機(jī)械法比較好。只需進(jìn)行細(xì)胞周期或DNA倍體分析的，在機(jī)械法的基礎(chǔ)上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）比較好。

抗凝劑的選擇：

外周血標(biāo)本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果采用同一份血液標(biāo)本做白細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析，需要用EDTA抗凝；對于血小板分析的實(shí)驗(yàn)，通常不需要用肝素抗凝。骨sui穿刺液一般使用肝素或EDTA抗凝。因?yàn)橄鄬Υ罅康腁CD會改變pH，從而可能影響骨sui細(xì)胞活性，所以一般不推薦使用ACD作骨sui穿刺液的抗凝劑。

樣本的保存：

理想狀態(tài)下，樣本需要在采集后立即進(jìn)行處理和染色。肝素抗凝的血和骨sui在室溫條件下一般可以保存至48-72小時；EDTA抗凝的外周血和骨sui在室溫條件下一般可以保存12-24小時；ACD抗凝的外周血在室溫條件下一般可以保存至72小時；對于只作胞內(nèi)染色的樣本，可以固定細(xì)胞以便長期保存。然而“固定－染色”的方法是由要分析的抗原特性和染色方式?jīng)Q定的。

去除紅細(xì)胞的方法：

紅細(xì)胞裂解法，操作簡單、速度快、并Z可能保持原始標(biāo)本的白細(xì)胞分布。Z好在染色后溶血。如果要在染色前溶血，要保證：

（1）溶血過程中抗原性不能被改變；

（2）溶血劑徹底被洗去，細(xì)胞和抗體結(jié)合的動力反應(yīng)沒有受到影響；

（3）所用的溶血劑不含固定劑，否則會影響細(xì)胞活性及表面標(biāo)記結(jié)果。密度梯度離心法，靶細(xì)胞回收較好并可能得到富集，同時去除紅細(xì)胞、碎片等。

細(xì)胞與抗體的比例：

廠家推薦的抗體用量一般是假設(shè)靶細(xì)胞數(shù)量在5*10的五次方-1*10的六次方之間。一些標(biāo)本沒有足夠的細(xì)胞，一些標(biāo)本的細(xì)胞量過大，正常濃度下的抗體相對過量或不足，可能會造成假陽性或假陰性結(jié)果。所以，每個實(shí)驗(yàn)室需要根據(jù)于廠家推薦的方法不同的方法，調(diào)整細(xì)胞與抗體用量，得到Z合適的細(xì)胞/抗體比例。

細(xì)胞活性的鑒定：

死細(xì)胞對許多抗體都有很強(qiáng)的非特異性染色，所以樣本細(xì)胞活性檢測尤為重要，特別是經(jīng)過長時間運(yùn)輸和儲存的樣本。一般有三種檢測的方法：

（1）實(shí)時的流式檢測：

利用PI、7-AAD或EMA進(jìn)行死細(xì)胞染色，而活細(xì)胞拒染這些染料。這個方法的優(yōu)勢是細(xì)胞表面標(biāo)志和活性分析能夠同時進(jìn)行。對于高度壞死的樣本特別適用。7-AADZ常用，因?yàn)樵?88nm激發(fā)下，其Zda發(fā)射光在670nm左右，適合與FITC或PE進(jìn)行多色標(biāo)記。然而隨著時間延長，7-AAD會在固定的細(xì)胞群體重新分配，死活細(xì)胞的區(qū)分變得困難。所以，對于染色并在固定后12小時以上分析的標(biāo)本，Z好用EMA。EMA與死細(xì)胞DNA穩(wěn)定的共價結(jié)合保證了長時間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。

（2）手工檢測：

使用Trypanblue或其他細(xì)胞活性染料。

（3）使用專門的儀器進(jìn)行檢測。