PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡(jiǎn)稱(chēng)，是一種酶促化學(xué)反應(yīng)，可以在試管里將待測(cè)的目的基因在很短的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增五十萬(wàn)倍乃至上百萬(wàn)倍，大大提高了基因診斷的靈敏度，降低了分析的難度。PCR法是目前基因診斷中使用Z多的方法。下面就讓小編帶你了解一下PCR的反應(yīng)流程。

PCR反應(yīng)流程

1.溫度與時(shí)間的設(shè)置

對(duì)變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行設(shè)置。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中，采用三溫度點(diǎn)法，當(dāng)溫度為90-95攝氏度時(shí)，雙鏈DNA變性，再將溫度迅速降低到40-60攝氏度退火，Z后將溫度提升到70-75攝氏度延伸。對(duì)于長(zhǎng)度為100-300bp的短靶基因，可以采用二溫度點(diǎn)法，就是將退火和延伸的溫度合二為一，通常在94攝氏度變性，在65攝氏度左右退火和延伸。

（1）變性溫度和時(shí)間

變性的溫度通常為93-94攝氏度，使模板變性的時(shí)間1分鐘足夠，如果溫度小于93攝氏度，那么需要適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。然而溫度不能夠過(guò)高，否則會(huì)影響酶的活性。

（2）退火溫度與時(shí)間

退火溫度會(huì)對(duì)PCR特異性產(chǎn)生重大的影響。靶基因序列的長(zhǎng)度、堿基組成和濃度以及引物的長(zhǎng)度決定了退火的溫度和時(shí)間。

在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可以使得引物和模板間的非特異性結(jié)合大大減少，從而使得PCR反應(yīng)的特異性提高。

（3）延伸溫度與時(shí)間

延伸的溫度通常在70-75攝氏度之間選擇。72攝氏度為延伸常用的溫度，如果延伸的溫度過(guò)高，那么會(huì)對(duì)引物和模板的結(jié)合不理。延伸的反應(yīng)時(shí)間取決于待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。如果DNA片段的長(zhǎng)度在1kb以?xún)?nèi)，那么延伸時(shí)間1分鐘足夠。如果靶序列的長(zhǎng)度為3-4kb，延伸時(shí)間需要3-4分鐘，如果擴(kuò)增10kb的長(zhǎng)度，那么延伸時(shí)間需要到15分鐘。如果延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的話，會(huì)引起非特異性擴(kuò)增，如果擴(kuò)增的模板濃度低，那么需要適當(dāng)延長(zhǎng)延伸時(shí)間。

2.循環(huán)次數(shù)

循環(huán)的次數(shù)決定了PCR的擴(kuò)增程度，循環(huán)的次數(shù)主要由模板DNA的濃度決定。循環(huán)的次數(shù)一般選在30次左右，循環(huán)的次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量也隨之增加。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳（Z常用）、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測(cè)序、限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析、分子雜交、層析技術(shù)：GX液相色譜（HPLC）和離子交換層析（IEC）以及聚丙烯酰胺凝膠電泳。