使用柱子和泵系統(tǒng)來對HPLC進行分析，能夠對高壓經受傳遞，如此填料能夠采用極細的微粒（3-10μm），所以需要在幾分鐘以內對多肽進行高度的分析。

HPLC分類

HPLC包括離子交換和反相兩類。

和正常層析相比，反相HPLC條件恰恰相反。通過疏水作用，多肽在柱上連接，洗脫采用將離子強度降低的方式，例如將洗脫劑的疏水性增加。一般由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成柱子這種鏈為G4-G8碳原子那么長。因為洗脫是一種疏水作用，所以用短鏈柱對大的疏水肽進行洗脫比較好。但是，在具體的實驗中，這兩類柱互變的區(qū)別不是非常的顯著。由碳水化合物構成如苯基的別類載體。

離子交換HPLC是以多肽和固相間的直接電荷相互作用為依靠。在一定PH范圍，一種離子體由柱子帶有的特定電荷衍變而成，但是相反電荷由多肽或多肽混合物的氨基酸組成表現出來。一種電荷相互作用叫做分離，洗脫出多肽方法為改變離子強度或者PH或者將兩者均改變。一般，低離子強度的溶液首先使用，再將離子強度一步一步加強，直到從柱中洗脫出多肽。使用強陽離子交換柱為離子交換分離的一個例子。

一般80%acetonitrile0.1%TFA--H2o稀acetonitrile和0.1%TFA-H2O這兩種緩沖劑組成典型的操作。以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度用線型梯變進行混合。如果用徑向填柱，那么大小是25×250mm(10μm)和(10μm).8×100（3-10μm），如果為常見分析和純化用柱，那么大小為4.6×250mm(3-10μm)和22×250mm。

有許多不同的試劑包含在各種緩沖劑中，值得一提的是在高pH或者微堿pH下能長時間暴露硅反相柱料，否則會對柱子產生破壞。