流式細(xì)胞術(shù)為一種生物學(xué)技術(shù)，計(jì)數(shù)和分選懸浮于流體中的微小顆粒是它的主要用途。這種技術(shù)能夠用來連續(xù)的多參數(shù)的分析流過光學(xué)或電子檢測器的一個(gè)個(gè)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)（Flow CytoMetry，F(xiàn)CM）是通過檢測標(biāo)記的熒光信號(hào)使高速、逐一的定量分析和分選懸液中的單細(xì)胞或其他生物粒子得以實(shí)現(xiàn)的技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則

1、將紅細(xì)胞去除的方法

紅細(xì)胞裂解法，有著簡單的操作，比較快的速度，并且使原始標(biāo)本的白細(xì)胞分布盡可能保持。建議在染色后溶血。若需要在染色前溶血，則應(yīng)當(dāng)確保：

a、溶血過程中不能改變抗原性。

b、徹底洗去溶血?jiǎng)瑳]有影響到細(xì)胞和抗體結(jié)合的動(dòng)力反應(yīng)。

c、固定劑不包含在所用的溶血?jiǎng)┲?，不然?huì)對細(xì)胞活性及表面標(biāo)記結(jié)果產(chǎn)生影響。密度梯度離心法，能夠比較好的回收靶細(xì)胞，并且可能得到富集，同時(shí)將紅細(xì)胞、碎片等去除。

2、抗體與細(xì)胞的比例

假設(shè)靶細(xì)胞數(shù)量在5*10的五次方-1*10的六次方之間通常為廠家推薦的抗體用量。一些標(biāo)本擁有的細(xì)胞不足量，一些標(biāo)本的細(xì)胞擁有過多的細(xì)胞數(shù)量，假陽性或假陰性結(jié)果通常可能是由正常濃度下的抗體相對過量或不足導(dǎo)致的。因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室需要按照廠家推薦的方法來對細(xì)胞與抗體用量進(jìn)行調(diào)整，從而使Z合適的細(xì)胞/抗體比例獲得。

3、鑒定細(xì)胞活性

死細(xì)胞對許多抗體都有很強(qiáng)的非特異性染色，因此樣本細(xì)胞活性檢測非常重要，尤其是經(jīng)過長時(shí)間運(yùn)輸和儲(chǔ)存的樣本。通常有三種檢測的方法。

a.實(shí)時(shí)的流式檢測

死細(xì)胞利用PI、7-AAD或EMA進(jìn)行染色,這些染料不能夠?qū)罴?xì)胞進(jìn)行染色。能夠同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志和活性分析為這個(gè)方法的優(yōu)勢。尤其適用于高度壞死的樣本。Z常用的是7-AAD，由于在488nm激發(fā)下，670nm左右為其Z大發(fā)射光，與FITC或PE進(jìn)行多色標(biāo)記非常適合。但是隨著時(shí)間延長，在固定的細(xì)胞群體，會(huì)重新分配7-AAD，很難區(qū)分死活細(xì)胞。因此，EMA，對于染色并在固定后12小時(shí)以上分析的標(biāo)本是Z好的選擇。EMA與死細(xì)胞DNA穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合使長時(shí)間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)得以保證。

b.手工檢測

對Trypanblue或其他細(xì)胞活性染料進(jìn)行使用。

c、使用專門的儀器進(jìn)行檢測。

4、獲取單細(xì)胞懸液

天然的單細(xì)胞懸液包括骨sui穿刺液和外周血。酶消化和機(jī)械分離為兩種常用的活檢組織的方法。不同的方法適用于不同的實(shí)驗(yàn)。關(guān)于需要進(jìn)行膜抗原標(biāo)記的，除了需要將足夠多的單細(xì)胞懸液獲得，而且還要使細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性盡可能保證，機(jī)械法是比較好的選擇。僅需要進(jìn)行細(xì)胞周期或DNA倍體分析的，比較好的方法是在機(jī)械法的基礎(chǔ)上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）。

5、選擇抗凝劑

EDTA、ACD或肝素抗凝為外周血標(biāo)本所采用的抗凝劑。若做白細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析采用同一份血液標(biāo)本，則使用EDTA抗凝。一般肝素抗凝不用于血小板分析的實(shí)驗(yàn)。肝素或EDTA抗凝通常為骨sui穿刺液的抗凝劑。由于相對大量的ACD會(huì)將pH改變，從而可能會(huì)對骨sui細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，因此通常骨sui穿刺液的抗凝劑不推薦使用ACD。

6、保存樣本

在理想的狀態(tài)下，需要在采集后立即對樣本進(jìn)行處理和染色。對于只作胞內(nèi)染色的樣本，能夠?qū)⒓?xì)胞固定，為長期保存提供便利。在室溫條件下，通常能夠?qū)CD抗凝的外周血保存至72小時(shí)；在室溫條件下，通常能夠?qū)DTA抗凝的外周血和骨sui保存12-24小時(shí)；在室溫條件下，通常能夠?qū)⒏嗡乜鼓难凸莝ui保存至48-72小時(shí)。然而“固定－染色”的方法是由要分析的抗原特性和染色方式?jīng)Q定的。