微點(diǎn)陣芯片掃描儀是使用Z普遍芯片掃描儀，是用來(lái)檢測(cè)基因芯片雜交結(jié)果的裝置。典型的激光共聚焦微點(diǎn)陣芯片掃描儀具有熒光激發(fā)、釋放熒光采集、空間定位、釋放熒光與激發(fā)光分辨、熒光信號(hào)檢測(cè)等功能。

微點(diǎn)陣芯片掃描儀原理

　　微點(diǎn)陣芯片掃描儀被掃描的微點(diǎn)陣區(qū)域被看作由許多大小相等的像素組成。激光器產(chǎn)生激光(作為激發(fā)光)經(jīng)物鏡聚焦在微點(diǎn)陣表面的一個(gè)像素點(diǎn)上，該像素中的熒光素分子吸收激光光量子，從各個(gè)方向上釋放熒光光量子，并部分被物鏡捕獲。由于玻片的反射作用，物鏡同時(shí)也捕獲了反射回來(lái)的激光，且釋放熒光的光量子要比激光的光量子少幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

　　微點(diǎn)陣芯片掃描儀分辨的基本依據(jù)是釋放熒光波長(zhǎng)一般略長(zhǎng)于激發(fā)光波長(zhǎng)，分辨的基本功能是Zda限度通過(guò)被激發(fā)的熒光素釋放的熒光信號(hào)，而Zda限度地消除反射激光信號(hào)和其它由玻片、試劑、透鏡、DNA、另一熒光素等發(fā)出的非靶標(biāo)熒光信號(hào)。探測(cè)器的功能是將釋放熒光的光量子轉(zhuǎn)換成電流，Z常用的探測(cè)器是光電倍增管(PMT)。一個(gè)光電倍增管可將一個(gè)光量子轉(zhuǎn)換成多個(gè)電子，Z多可達(dá)100萬(wàn)個(gè)。放大率可通過(guò)改變PMT的電壓供應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)。

　　微點(diǎn)陣芯片掃描儀數(shù)模(A/D)轉(zhuǎn)換器將電子轉(zhuǎn)換成一系列的數(shù)字信號(hào)，數(shù)字化過(guò)程是個(gè)光量子時(shí)空平均化步驟，結(jié)果是每個(gè)像素產(chǎn)生一個(gè)代表其總熒光強(qiáng)度的數(shù)字信號(hào)。一個(gè)針孔光柵被置于PMT探測(cè)器之前，用于控制物鏡的聚焦深度，以便只有從玻片表面位置發(fā)出的熒光信號(hào)能被檢測(cè)到;即只有在玻片表面激發(fā)光聚焦點(diǎn)上被激發(fā)的熒光素的釋放熒光，才能由探測(cè)器透鏡組聚焦與針孔部位，恰好通過(guò)針孔。玻片表面以下或以上位置上產(chǎn)生的熒光信號(hào)(如由一片雜質(zhì)產(chǎn)生)達(dá)到針孔時(shí)，其聚焦點(diǎn)將在前述釋放熒光聚焦點(diǎn)之前或之后，故而只能有極少部分的光信號(hào)能通過(guò)針孔。

　　微點(diǎn)陣區(qū)域上不同像素點(diǎn)的連續(xù)掃描動(dòng)作，是通過(guò)馬達(dá)水平移動(dòng)芯片裝載平臺(tái)，或通過(guò)微反光鏡移動(dòng)入射激發(fā)光束，或兩者兼而有之來(lái)實(shí)現(xiàn)的，Z終獲得針對(duì)某色熒光標(biāo)記的圖像文件。而對(duì)于不同熒光標(biāo)記，則通過(guò)切換不同波長(zhǎng)的激光來(lái)激發(fā)相應(yīng)熒光素釋放熒光，同時(shí)切換選擇性通過(guò)不同波長(zhǎng)范圍的濾光片(即選擇不同熒光掃描頻道)來(lái)檢測(cè)相應(yīng)釋放熒光信號(hào)，重復(fù)掃描，分別獲得各色熒光標(biāo)記的圖像文件。

微點(diǎn)陣芯片掃描儀測(cè)試結(jié)果影響因素

　　有許多種“噪音”在掃搖圖像中形成背景信號(hào)干擾掃描結(jié)果，通常將噪音分為兩大類：源噪音除了未被消除的反射激光和非激發(fā)熒光素的干擾信號(hào)外，還有玻片上的雜質(zhì)、試劑、非特異性雜交或沉積的熒光素標(biāo)記靶分子、玻片本身、甚至DNA本身產(chǎn)生的熒光信號(hào)。探測(cè)器噪音主要是在信號(hào)放大和數(shù)字化過(guò)程中產(chǎn)生。

　　可以根據(jù)需要，通過(guò)調(diào)節(jié)掃描參數(shù)設(shè)置(如掃描率、激光能量PMT電壓等)來(lái)達(dá)到Z佳掃描效果。一般情況下，激光能量越高，將會(huì)激發(fā)更多熒光光量子，產(chǎn)生更強(qiáng)的源信號(hào)，同時(shí)也導(dǎo)致更強(qiáng)的源噪音。PMT的電壓越高，信號(hào)放大率越高，將會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的探測(cè)器信號(hào)，但同時(shí)也引發(fā)更強(qiáng)的探測(cè)器噪音。有些芯片掃描儀只有PMT電壓可調(diào)。此時(shí)，過(guò)高的PMT電壓將會(huì)導(dǎo)致像素“飽和”，通常PMT電壓被調(diào)節(jié)在Z亮的像素剛好低于“飽和”的水平。

微點(diǎn)陣芯片掃描儀的特性

　　微點(diǎn)陣芯片掃描儀是個(gè)復(fù)雜的檢測(cè)裝置，體現(xiàn)在大量的參數(shù)和規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)上。

　　1、檢測(cè)極限

　　檢測(cè)極限是指在熒光素分子以Zda光量子強(qiáng)度釋放熒光時(shí)，芯片掃描儀能夠成功地從背景信號(hào)中分辨并檢測(cè)到的Zdi斑點(diǎn)熒光信號(hào)。從掃描裝置角度來(lái)看，其度量單位應(yīng)是單位面積上熒光素分子數(shù)量，(但由于芯片制作和雜交過(guò)程的不可知性，研究者無(wú)法知道各個(gè)樣點(diǎn)上的熒光素分子的密度。因此，常用某個(gè)基因所能檢測(cè)到的Zdi表達(dá)水平來(lái)表示。

　　微點(diǎn)陣特性和芯片掃描儀特性均可能稱為檢測(cè)極限的限制性因素。如果芯片制作和雜交過(guò)程中引起熒光背景過(guò)高，則微點(diǎn)陣特性稱為限制因素。如果芯片掃描儀本身產(chǎn)生的噪音混入熒光素產(chǎn)生的熒光信號(hào)中無(wú)法除去，且當(dāng)噪音超過(guò)前述本底，芯片掃描儀特性成為限制性因素。

　　2、靈敏度和分辨率

　　靈敏度是指芯片掃描儀將特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的效率。靈敏度不依賴于微點(diǎn)陣芯片的熒光檢測(cè)特性。如果激發(fā)能力和探測(cè)器性能均已被調(diào)至Zda，微點(diǎn)陣上所能檢測(cè)的熒光信號(hào)仍然太弱，此時(shí)靈敏度對(duì)檢測(cè)極限起著限制作用。激發(fā)能力和探測(cè)器性能調(diào)至Zda的不足前文已述。芯片掃描儀的分辨率用單個(gè)像素大小來(lái)表示，通常為5、10、20啪;像素越小，分辨率越高。

　　微點(diǎn)陣區(qū)域是被分成多個(gè)像素單元進(jìn)行逐個(gè)掃描的，一般像素以不大于微點(diǎn)陣中Z小斑點(diǎn)直徑的1/8至1/10為基準(zhǔn)。比如，某個(gè)斑點(diǎn)直徑為100μm，當(dāng)分辨率為10μm時(shí)，有70個(gè)像索完整地落于斑點(diǎn)區(qū)域內(nèi)，當(dāng)分辨率為5μm時(shí)，則有300個(gè)像素完整地落于斑點(diǎn)。完整地落于斑點(diǎn)區(qū)域內(nèi)的像素、橫跨背景區(qū)域和斑點(diǎn)區(qū)域的像素、完整地落于背景區(qū)域內(nèi)的像素的熒光強(qiáng)度依次減弱，后兩者常被當(dāng)作背景信號(hào)用于校正。

　　因此，分辨率越高，越有利于在表達(dá)數(shù)據(jù)提取過(guò)程中消除斑點(diǎn)邊緣效應(yīng)和噪音的影響。當(dāng)然，單個(gè)斑點(diǎn)內(nèi)像素的增加會(huì)使單個(gè)像素感受激發(fā)光量和釋放熒光強(qiáng)度減少，導(dǎo)致靈敏度的犧牲。

　　3、激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光掃描頻道

　　微點(diǎn)陣技術(shù)采用兩種或兩種以上熒光素標(biāo)記，因此針對(duì)不同熒光素，芯片掃描儀應(yīng)可切換不同波長(zhǎng)的激光，并可通過(guò)調(diào)節(jié)濾光片組，即以不同掃描頻道選擇通過(guò)不同波段的熒光信號(hào)，達(dá)到分別對(duì)不同被激發(fā)的熒光素的熒光信號(hào)的檢測(cè)目的。單個(gè)激光器配以不同掃描頻帶會(huì)造成不同熒光素信號(hào)之間的干擾，多數(shù)情況下一個(gè)芯片掃描儀中具有多個(gè)激光器，分別產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的激光。