將熒光基團加入到PCR反應(yīng)體系中，通過不斷累積熒光信號從而使對PCR全程的實時監(jiān)測實現(xiàn)，再根據(jù)標準曲線定量分析未知模板的方法，即是熒光定量PCR技術(shù)。在實時熒光定量PCR中，實時檢測全程PCR擴增過程，按照反應(yīng)時間和熒光信號的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。

注意事項

1.操作規(guī)范

需要規(guī)范樣品核酸提取和實時熒光擴增時的操作，避免樣品交叉污染， 酶被降解，出現(xiàn)假陽性的情況。

（1）根據(jù)試驗的分區(qū)嚴格操作，按照提取區(qū)、擴增區(qū)、檢測區(qū)單方向流動，不能夠逆向流動物品、樣品和試劑。 

（2）在對多份樣品進行操作的時候，制備反應(yīng)混合液，首先混合好熒光PCR反應(yīng)液、熒光探針和酶。之后在每個PCR管中進行分裝，如此不僅會使操作次數(shù)減少，而且能夠使污染避免，還能夠使反應(yīng)的精確度增加。

（3）在對樣品和蛋白酶k添加的過程中，要對避免酶的降解和樣品的交叉污染尤其留心。

（4）在操作的時候，需要將陰性及陽性對照設(shè)立，能夠?qū)晒釶CR反應(yīng)的準確性和可信性進行驗證。

（5）使用的離心管、槍頭和PCR 管需要確保沒有污染，或者將它們進行高壓滅菌。

（6）在完成核酸的提取之后應(yīng)當立刻進行儀器的擴增，不能夠在室溫環(huán)境下過長時間放置提取的核酸，空氣中的酶能夠輕易的將其降解，其可以在－70 ℃冰箱內(nèi)長期保存，在 －20 ℃冰箱內(nèi)短期保存。

（7）因為產(chǎn)物氣溶膠或標本 DNA 會很容易對移液器造成污染，所以需要使用可高壓處理的移液器。

2.溫度設(shè)置

在對熒光 PCR 程序進行設(shè)置的時候，應(yīng)當需對程序中的目標溫度、恒溫時間和循環(huán)次數(shù)等參數(shù)仔細的核對，PCR 檢測結(jié)果會受到不正確的參數(shù)設(shè)置的影響。延伸過程中，需要對熒光信號的讀取收集進行設(shè)置。如果不對收集熒光進行設(shè)置，那么試驗數(shù)據(jù)將無法保存，檢測結(jié)果將沒有辦法判定，從而導(dǎo)致試驗失敗。

3.儀器擺放

放置實時熒光定量 PCR 儀的臺面應(yīng)當平穩(wěn)，離水池較遠，少灰，干燥，不能有強光直射，室內(nèi)應(yīng)當沒有腐蝕性氣體合良好的通風。