相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細(xì)節(jié)，適用于對活體細(xì)胞生活狀態(tài)下的生長、運(yùn)動(dòng)、增殖情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察。相差顯微鏡是微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、細(xì)胞工程、雜交瘤技術(shù)等現(xiàn)代生物學(xué)研究的必備工具。

相差顯微鏡的工作原理

　　顯微鏡檢查時(shí)，視場中的樣品只有在其透射光的波長(顏色)和振幅(亮度)與周圍介質(zhì)有明顯變化時(shí)，才能被眼睛所分辨。照明光線通過無色透明的物體時(shí)，透射光的波長和振幅都不發(fā)生明顯改變，尤其是振幅，幾乎無變化。用普通光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，難以辨清這樣物體的結(jié)構(gòu)，必須借助于相差顯微鏡，使用固定和染色等理化方法，使樣品和背景的透射光在波長或振幅上發(fā)生變化，即在顏色和亮度上有所差異，以供識(shí)別。

　　一束光線在透過折射率不同的透明介質(zhì)后，產(chǎn)生的衍射光和透過的直射光的波長沒有明顯變化，只是衍射光的振幅稍小于直射光，這也是透明不均質(zhì)物質(zhì)產(chǎn)生些許明暗變化的原因，但這一點(diǎn)變化很小，并不能有效分辨。變化明顯的是衍射光相對透射光在相位上有1/4λ的滯后，雖然人眼不能分辨相位的差別，但可以分辨振幅和波長的變化。相差顯微鏡就是利用這一點(diǎn)，將相位的差別轉(zhuǎn)變成振幅的變化，也就是將本來均為透明但折射率不同的各個(gè)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)出明暗差距，從而可以被清楚地分辨。

　　可見光光線通過介質(zhì)水或其他小分子勻質(zhì)物質(zhì)時(shí)，由于介質(zhì)分子遠(yuǎn)小于可見光波長，所以光的衍射現(xiàn)象并不明顯，可以說透射光是直射光。但當(dāng)可將光透過細(xì)胞結(jié)構(gòu)或其他粒徑與入射光波長相近的物質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生明顯的衍射現(xiàn)象，透射光轉(zhuǎn)化為衍射光。也就是說，細(xì)胞等常見觀察物的結(jié)構(gòu)大小剛好可以使可將光產(chǎn)生衍射現(xiàn)象。相差顯微鏡就是利用這一點(diǎn)。光波通過小顆粒的物體后產(chǎn)生直射光和衍射光，衍射光的光波振幅小，相位滯后。在光學(xué)系統(tǒng)中，這種直射光和衍射光相遇或光的疊加，振幅發(fā)生變化，光線或明或暗，就是光的干涉現(xiàn)象。

相差顯微鏡的特點(diǎn)

　　相差顯微鏡把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ(波長)，如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。

　　在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處：

　　1、環(huán)形光闌：位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。

　　2、相位板：在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

　?、貯+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差(或稱負(fù)反差)。

　?、贐+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差(或稱正反差)，結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。

相差顯微鏡使用注意事項(xiàng)

　　為了更好地發(fā)揮相差顯微鏡的效果，應(yīng)注意以下幾個(gè)方面。

　　1、光源強(qiáng)：光源要強(qiáng)，相差顯微鏡聚光鏡中的環(huán)狀光闌遮掉大部分光源，所以應(yīng)將視場光闌和孔徑光闌完全開啟。

　　2、單色光：為了獲得良好效果，相差顯微鏡應(yīng)使用波長范圍窄的近于單色的光源，相位的變化常因照明光線的波長而不同。通常采用綠色濾光片來調(diào)整光源波長，Z好按廠家專用相襯鏡檢的綠色濾光片進(jìn)行鏡檢。

　　3、切片薄：切片不能太厚，以5~10μm左右為宜，或者更薄。如果樣品過厚，樣品的上層是很清楚的，深層則會(huì)模糊不清并且會(huì)產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾，影響相差顯微鏡成象質(zhì)量。

　　4、蓋玻片和載玻片：載玻長、蓋玻片的厚度應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)，且不應(yīng)有疵痕，制片的封固劑應(yīng)均勻一致。如果有劃痕，厚薄不均或凹凸不平，則會(huì)產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。玻片過厚或過薄會(huì)使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。相差顯微鏡觀察時(shí)要蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。

　　5、物鏡與聚光鏡匹配：注意相差物鏡和聚光鏡里的相差環(huán)要調(diào)成對應(yīng)的。簡單的方法就是物鏡上的Ph標(biāo)示與聚光鏡上的標(biāo)示相同，換物鏡時(shí)一定要記得把聚光鏡轉(zhuǎn)到對應(yīng)的位置。

　　6、相位倒轉(zhuǎn)：當(dāng)n'<n或n'>n時(shí)相差顯微鏡得到象的明暗反差正好相反，稱為相位倒轉(zhuǎn)。當(dāng)相位差δ=0時(shí)是無法識(shí)別的，隨著δ的增大反差變大，當(dāng)δ繼續(xù)增大到某一值后會(huì)出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值(高反差)物鏡時(shí)，這個(gè)轉(zhuǎn)變值約為0.55λ，用70%標(biāo)準(zhǔn)吸光值的物鏡時(shí)約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。

　　7、暈輪和漸暗效應(yīng)：在相差顯微鏡成象過程中，某一結(jié)構(gòu)由于相位的延遲而變暗時(shí)，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結(jié)果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會(huì)在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個(gè)明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點(diǎn)，它妨礙了精細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察，當(dāng)環(huán)狀光闌很窄時(shí)暈輪現(xiàn)象更為嚴(yán)重。相差顯微鏡的另一個(gè)現(xiàn)象是漸暗效應(yīng)，指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時(shí)，該區(qū)域邊緣會(huì)出現(xiàn)反差下降。