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2025-01-21 09:33:41腫瘤轉(zhuǎn)移實驗分析: 腫瘤轉(zhuǎn)移實驗分析是研究腫瘤細胞從原發(fā)部位擴散至其他部位的過程及其機制的實驗方法。該實驗通常涉及將腫瘤細胞接種到動物模型或體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，觀察其遷移、侵襲和定殖能力。通過分析腫瘤細胞的生物學(xué)特性、遺傳變異、微環(huán)境等因素，可以揭示腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子機制和信號通路。該分析對于理解腫瘤進展、預(yù)測轉(zhuǎn)移風(fēng)險及開發(fā)抗轉(zhuǎn)移療法具有重要意義。

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安捷倫公益捐贈西交利物浦大學(xué)慧湖藥學(xué)院傅磊教授團隊

傅磊教授團隊將使用安捷倫xCELLigence 實時細胞分析儀 (RTCA)進行腫瘤轉(zhuǎn)移實驗分析，探究篩選化合物對腫瘤細胞中的作用。

安捷倫科技（中國）有限公司 653
2022-04-02
安捷倫xCELLigenc 實時細胞分析儀 (RTCA) 腫瘤轉(zhuǎn)移實驗分析

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腫瘤轉(zhuǎn)移實驗分析問答

2023-02-15 14:27:47腫瘤疫苗生物學(xué)活性評估: 腫瘤疫苗背景腫瘤疫苗，是一種具有預(yù)防和治療潛力的有吸引力的替代免疫治療選擇，是近年研究的熱點之一。針對腫瘤相關(guān)抗原（Tumor-associated antigen,TAA）或腫瘤特異性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特異性地攻擊和破壞抗原過表達的惡性細胞，并由于免疫記憶而實現(xiàn)慢性治療反應(yīng)。因此，與其他免疫療法相比，癌癥疫苗提供了特異性、安全性和可耐受的治療。根據(jù)腫瘤抗原的組分，癌癥疫苗大致可以分為四種類型：基于 DNA 的疫苗，基于 RNA 的疫苗，基于多肽的疫苗和基于免疫細胞的疫苗。FDA 批準(zhǔn)的首個個性化腫瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一種基于免疫細胞的疫苗，用于激素難治性前列腺癌的治療。除此之外，Moderna，BioNTech 都在布局基于 mRNA 的腫瘤疫苗。圖 1 腫瘤疫苗抗原呈遞平臺示意圖腫瘤疫苗有效性評估方法生物體接種疫苗后，腫瘤抗原被帶到淋巴結(jié)，進而激活抗原特異性的 B 細胞和 T 細胞，活化的 B 細胞產(chǎn)生的抗體及活化的效應(yīng) T 細胞會使腫瘤內(nèi)脹并誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡。圖 2 腫瘤疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)示意圖如何有效的評估腫瘤疫苗的有效性是一個非常值得探討的問題，常用的腫瘤疫苗有效性驗證的方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、T 細胞活化標(biāo)志物檢測、抗體滴度檢測、ADCC 檢測等。1、細胞因子檢測細胞因子是由免疫細胞經(jīng)過刺激而合成并分泌的小分子蛋白質(zhì)，在免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用，因此可以通過細胞因子的分泌能力來反應(yīng)疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫的水平。常見的細胞因子有白介素 (IL) 、干擾素 (IFN)、腫瘤壞死因子 (TNF) 等。下面比較了幾種常見的檢測方法。ELISA 是一種非常經(jīng)典的細胞因子的檢測方法，例如在王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中，提到了用 ELISA 的方法檢測接種疫苗后小鼠骨髓源樹突狀細胞（BMDCs）分泌細胞因子的能力，檢測方法如下：BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃下培養(yǎng) 6 天，然后以每孔 5×104 細胞的密度在 96 孔板中接種。以 5μM 或 10μM 的最終濃度加入疫苗抗原，孵育 24 小時。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 試劑組定量培養(yǎng)上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕獲抗體包被 ELISA 板過夜，然后在室溫下依次加入阻斷液、細胞培養(yǎng)上清和檢測抗體，孵育 1h 。最后加入終止液和顯色劑，用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。檢測結(jié)果如下：從檢測結(jié)果可以看出，T7（TLR7 激動劑）的存在可以顯著提升 ML/MB 抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。圖 3 ELISA 法測定小鼠骨髓樹突狀細胞 (BMDCs) 分泌TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平Ankita Leekha 等人發(fā)表的關(guān)于 SRAS-COV2 疫苗文章中，提到了用 ELISPOT 的方法評估細胞因子的分泌水平，可以作為參考。具體方法如下：從小鼠中分離脾細胞和肺細胞，使用小鼠 IFNγ ELISpot 基礎(chǔ)試劑盒和小鼠 IL4 ELISpot 基礎(chǔ)試劑盒 (Mabtech, VA, USA) 進行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 檢測。在 37℃ 下，在預(yù)包被抗體的 ELISpot 板中，用抗原刺激脾細胞和肺細胞，培養(yǎng) 16-18 小時。第二天，洗掉細胞，加入生物素化的檢測抗體。洗板后，加入 1:30000 稀釋的 Extravidi-ALP 偶聯(lián)物，室溫孵育 1 小時。洗板后，每孔添加 70μL 顯色液，孵育 20-30min，形成斑點，然后用水清洗，干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 對斑點進行量化。每個點對應(yīng)一個單獨的細胞因子分泌細胞。檢測結(jié)果如下：圖 4 ELIPSOT 方法檢測小鼠脾細胞和肺細胞分泌細胞因子的水平2、CTL 活性檢測疫苗誘導(dǎo)的細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 可以直接殺傷腫瘤細胞，起到抗腫瘤的作用，因此可以通過檢測 CTL 的殺傷效應(yīng)來反應(yīng)疫苗的效果。常用的檢測細殺傷效應(yīng)的方法有很多，下表列舉了一些常用的方法。王曉東等人發(fā)表的文章中提到了 LDH 檢測，檢測方法如下：從接種疫苗小鼠的脾臟中分離淋巴細胞（效應(yīng)細胞）。EAC 腫瘤細胞（靶細胞）與淋巴細胞（效應(yīng)細胞-靶細胞比例為 50:1）共培養(yǎng) 4h，使用乳酸脫氫 (LDH) 法測定細胞毒性。將培養(yǎng) 4h 后的培養(yǎng)上清加入在 ELISA 板中，室溫下加入底物溶液，孵育 30min。最后，加入終止液終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 490nm 處檢測光密度。檢測結(jié)果如下：相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組 CTL 細胞具有顯著的殺傷效應(yīng)。圖 5 LDH 法測定 CTL 介導(dǎo)的 EAC 靶細胞的裂解水平3、抗體滴度及親和力檢測腫瘤疫苗除了可以誘導(dǎo)細胞免疫之外，也可誘導(dǎo)體液免疫，對此可通過對抗體滴度及親和力進行檢測來反應(yīng)疫苗抗腫瘤的效果，ELISA 是一種非常經(jīng)典的檢測方法。上述關(guān)于胃癌疫苗的文章中通過 ELISA 方法測定小鼠接種疫苗后血清中總 IgG 含量，具體檢測過程如下：小鼠接種疫苗后收集血液樣本，通過 3000g 離心 15 分鐘獲得血清樣本。ELISA 板預(yù)先在 4℃ 包被 BSA-MG1 過夜，然后在室溫下依次加載封閉溶液 2h，血清樣品 (1:50 稀釋) 和檢測抗體 1h。最后，在體系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和終止液，用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 405nm 處記錄 OD 值。檢測結(jié)果如下：相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組抗體含量明顯上升。圖6 ELISA法測定疫苗誘導(dǎo)的血清抗體水平除此之外，在 Emily C. Gale 等人發(fā)表的關(guān)于 mRNA 遞送系統(tǒng)及輔劑研究的文章中，通過 ELISA 的方法測定了 mRNA OVA 模式疫苗誘導(dǎo)的 OVA 特異性抗體的絕對含量及其親和力。具體檢測方法如下：抗體濃度：小鼠接種加強疫苗后，采集血液樣品，血清按照 1:100 000 進行稀釋。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 試劑，按照試劑廠家的說明進行 ELISA 實驗。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清抗體濃度，表示 mg/mL。抗體親和性：將 12 個梯度稀釋的血清與恒定濃度標(biāo)記 HRP 的 anti-OVA 抗體 (3nM) 混合，并在 OVA 抗原包被的板中室溫孵育 2 小時，洗板后用 TMB 底物孵育，用 HCl 停止反應(yīng)。測定 450nm 處的 OD 值。根據(jù)業(yè)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的單克隆抗體的共同親和力，假設(shè)對照抗體的 KD 為 1nM 對實驗組的 KD 值進行統(tǒng)計。這一假設(shè)僅影響報告的絕對 KD 值，而不影響實驗組之間的相對差異。檢測結(jié)果如下：pIC 為雙鏈 RNA 結(jié)構(gòu)模擬物，圖E中比較了可溶性的 pIC 和不同納米顆粒遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)的絕對抗體含量，從圖 E 中可以看出 2B 遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)的 OVA 特異性抗體含量最高。從F和G可以看出 2B 遞送系統(tǒng)相對于可溶性 pIC 來說誘導(dǎo)的 IgG 親和力也顯著升高。圖 7 pIC/PBAE NPs 增強體液免疫4、ADCC 檢測疫苗誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生的抗體能夠捕捉目標(biāo)抗原，阻斷這個靶分子的功能，也可以引導(dǎo)其他免疫細胞（如巨噬細胞和自然殺傷細胞）殺死表達抗原的靶細胞，在腫瘤治療中，特別是血液腫瘤中，抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用 (ADCC) 起著關(guān)鍵作用，ADCC 常用的檢測方法包括細胞活力檢測、LDH 檢測、工程細胞株、Delfia、RTCA、細胞成像檢測等。王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中，提到了 LDH 方法檢測 ADCC，檢測方法如下：小鼠接種疫苗后，采集其血清樣本（1:25 稀釋），然后與 EAC 細胞（靶細胞）在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 細胞分離試劑盒從正常 BALB/c 小鼠中分離出自然殺傷 (NK) 細胞（效應(yīng)細胞），與抗體標(biāo)記的 EAC 細胞以效靶比 50:1 共培養(yǎng) 4 小時。采用 LDH 法 (Promega) 測定細胞毒性，檢測方法與之前提到的 CTL 活性檢測的方法一致。檢測結(jié)果如下：相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組產(chǎn)生的抗體具有顯著的殺傷效應(yīng)。圖 8 LDH 法測定血清抗體介導(dǎo)的 EAC 靶細胞的裂解水平腫瘤疫苗生物學(xué)活性檢測解決方案推薦本文介紹了腫瘤疫苗活性檢測的常用方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、抗體滴度及親和力檢測、ADCC 檢測等方法，涉及到了酶標(biāo)儀、成像系統(tǒng)、流式、RTCA、洗板分液系統(tǒng)等設(shè)備。Agilent 細胞分析事業(yè)部可以從多個角度為用戶提供從樣品處理，到結(jié)果檢測再到數(shù)據(jù)分析的全面解決方案。

2022-11-16 17:08:25樣本提取實驗|組織研磨儀在樣品前處理實驗分析中的應(yīng)用: 　　在分子生物學(xué)的研究實驗應(yīng)用中，DNA和RNA被統(tǒng)稱為核酸，同時也是樣本研究和檢測的基本對象；而如何獲得高質(zhì)量的核酸已成為一項基本且重要的實驗技術(shù)。為了更好的提取樣本核酸做好樣品前處理操作，通常對會選擇應(yīng)用組織研磨儀設(shè)備來進行操作應(yīng)用?！　《鄻悠方M織研磨儀是實驗室樣品制備的常用儀器設(shè)備之一，可快速粉碎和均相化各種生物組織，同時，還可選擇不同規(guī)格的球磨罐和磨球，以滿足不同待測樣本的實驗需求；可對生物細胞樣品進行研磨、破碎，提取樣本DNA/RNA，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、食品、質(zhì)檢、高校等行業(yè)領(lǐng)域?！　　　《鄻悠费心ピO(shè)備還可對樣品實驗分別進行干磨、濕磨和低溫冷凍研磨，且可同時放置多個樣品管，高通量大批量處理樣品組織，可滿足用戶一次研磨前處理大量樣品的需求。　　　　實驗室多樣品研磨設(shè)備可放置多個球磨罐也可放置可裝載多個樣品管的適配器搭載進行應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)對大批量樣品少批次研磨的目的，同時封閉狀況的離心管能夠有效避免樣品間的交叉污染，對于樣品前處理程序參數(shù)可進行實時儲存和設(shè)置調(diào)節(jié)，能夠更好的處理樣品組織；儀器的高速運動可帶動驅(qū)動球磨罐和罐內(nèi)的磨球的高速往復(fù)運轉(zhuǎn)，在運轉(zhuǎn)過程中可產(chǎn)生動能，使其對樣品可造成沖擊、擠壓、摩擦，進而來實現(xiàn)對生物樣品的細磨。

2022-12-06 13:04:21探秘腫瘤微環(huán)境，原位“看透”細胞因子: 細胞因子是腫瘤微環(huán)境（Tumor Microenvironment,TME）中細胞通訊的關(guān)鍵介質(zhì)，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后等多個方面發(fā)揮重要作用。在過去的 40 年中，細胞因子和細胞因子受體作為癌癥靶點或癌癥治療方法得到了廣泛的研究。目前公認(rèn)的臨床前治療策略為增強干擾素和白細胞介素（包括 IL-2 ，IL-7 ，IL-12 和 IL-15 ）的生長抑制和免疫刺激作用，或抑制細胞因子（如 TNF ，IL-1β 和 IL-6 ）的炎癥和促進腫瘤的作用[1]。圖 1 . 細胞因子在腫瘤微環(huán)境中的作用特定細胞因子的表達也與腫瘤細胞的高存活率和高轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)。其中促炎細胞因子 IL-6 和 IL-8 與多種癌癥相關(guān)，包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌等 [2,3]。因此，分析細胞因子的表達是一種重要的診斷工具和預(yù)測癌癥預(yù)后的關(guān)鍵因素。非放射性的 RNA 原位雜交技術(shù)（ViewRNA ISH）是一種高靈敏度的檢測細胞因子表達的有效方法，并且可以對 1 至 4 個 mRNA 目標(biāo)進行多重分析。檢測原理如下圖所示：圖 2 . ViewRNA ISH 檢測原理安捷倫BioTek Cytation 5 多功能細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)，可容納多達四個熒光通道同時成像，快速并出色地成多色熒光成像。儀器配備的高內(nèi)涵分析軟件可自動計算細胞內(nèi) RNA 的表達水平。Cytation 5 活細胞成像工作站結(jié)合ViewRNA ISH，為細胞因子研究提供了一種高效率、高靈敏度和可重復(fù)的檢測方法。實驗案例分享實驗一．細胞因子mRNA的成像和分析為研究細胞因子mRNA 在不同營養(yǎng)條件下的表達情況，設(shè)置兩組對照實驗。陽性對照細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，而陰性對照細胞經(jīng)過 18 小時的血清饑餓處理。隨后加入 ViewRNA 探針以標(biāo)記 IL-6 、IL-8 和 ACTB mRNA ，在Cytation 5 上分別使用 RFP 、GFP 、Cy5 和 DAPI 通道對探針進行成像完成 ISH 細胞分析。圖像結(jié)果表明：細胞因子mRNA 的表達在營養(yǎng)匱乏的條件下會顯著降低。圖 3 . 陽性和陰性對照組成像。HCT116 放大 20 倍圖像作為（ A ）陽性對照和（ B ）陰性對照。MDA-MB-231 細胞放大 40 倍的圖像作為（ C ）陽性對照和（ D ）陰性對照。藍色：DAPI 染色的細胞核；綠色：標(biāo)記 IL-8 mRNA ；橙色：標(biāo)記 IL-6 mRNA ；紅色：標(biāo)記 ACTB mRNA 。接下來為了定量分析細胞因子表達，首先在 Cytation 5 的 DAPI 通道下進行細胞核計數(shù)，以確定每孔的細胞數(shù)量（圖 4A ）。然后分別在GFP 、RFP 通道進行細胞因子探針（ IL-6 或 IL-8 ）的熒光信號分析（圖 4B ）。通過細胞熒光信號的比率評估不同實驗條件下的細胞因子表達（圖 5 ）。圖 4 . 每個細胞的熒光信號分析。( A ) 使用 Agilent-BioTek Gen5 軟件進行細胞分析圈選出 DAPI 標(biāo)記的細胞核；( B ) 熒光標(biāo)記的 IL-8 信號的圖像分析。如圖 5 所示，使用 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合準(zhǔn)確的量化了細胞內(nèi) IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達。圖 5 . MDA-MB-231 細胞中 IL-8 表達和 HCT116 細胞中 IL-6 表達，并以細胞數(shù)目進行校正。實驗二．誘導(dǎo)細胞因子 mRNA 的表達使用不同劑量的 IL-1β 刺激 DU145 細胞，以分析細胞因子的 mRNA 的表達（圖6）。圖 7 結(jié)果顯示：雖然 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 表達增加，但 IL-8 的表達變化更為顯著，這與先前研究結(jié)果一致[4]。IL-1β 的最高劑量下，這兩種細胞因子的表達減少則是由于細胞毒性。這驗證了該檢測方法的可行性與穩(wěn)定性。圖 6 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下的 IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號 ( A ) 0 ng/mL；( B ) 0.02 ng/mL ；0.128 ng/mL；( D ) 0.8 ng/mL。藍色：DAPI染色的細胞核；綠色：標(biāo)記的IL-8 mRNA；橙色：標(biāo)記的 IL-6 mRNA ；紅色：標(biāo)記的 ACTB mRNA 。圖 7 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下 DU145 細胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達。實驗三．抑制細胞因子 mRNA 的表達研究表明絲裂原活化蛋白激酶（ MAPK ）可調(diào)節(jié) IL-8 ，并證明用 MAPK/ERK 抑制劑 U 0126 治療可減少 DU145 和 MDA-MB-231 細胞中的炎癥細胞因子[4,5]。為了確認(rèn)這一現(xiàn)象并驗證 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合的能力，將不同濃度的 U 0126 加入到每種細胞類型中孵育 30 分鐘。然后用 1 ng/mL 的 IL-1β 刺激 DU145 細胞達 3 小時，而 MDA-MB-231 細胞未被刺激。使用 GFP 和 RFP 通道進行細胞計數(shù)和圖像分析以評估在 U 0126 治療后 IL-8 和 IL-6 細胞因子 mRNA 的表達。采集的圖像（圖 8 ）和計算的熒光信號強度（圖 9 ）證實了 U 0126 的抑制作用。此外，也驗證了該方法的靈敏度，可以準(zhǔn)確識別給予抑制劑后 mRNA 的表達變化。圖 8. U 0126 抑制 IL-8 mRNA 的表達。圖像顯示了在不同濃度的 U 0126 處理后 ( A-E ) MDA-MB-231 細胞內(nèi) IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號；( F-J ) 為 DU145 細胞。藍色：DAPI 染色的細胞核；綠色：標(biāo)記的 IL-8 mRNA ；橙色：標(biāo)記的 IL-6 mRNA ；紅色：標(biāo)記的 ACTB mRNA 。圖 9 . U 0126 治療后 IL-8 和 IL-6 mRNA 在 MDA-MB-231 和 DU 145 細胞中的表達結(jié) 語ThermoFisher 的 ViewRNA ISH 細胞分析試劑盒和探針提供一種靈敏的方法來檢測 mRNA 表達。該方法在安捷倫BioTek Cytation 5 細胞成像系統(tǒng)的加持下得以更更快地采集多熒光通道的圖像，并更精準(zhǔn)的計算出每一個細胞的熒光信號強度。這種檢測、成像和分析的完美結(jié)合提供了一種靈敏、靈活和高通量的方法用以檢測細胞因子 mRNA 的表達。參考文獻：[1] Propper DJ, Balkwill FR. Harnessing cytokines and chemokines for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Apr;19(4):237-253.[2] Kampan NC, Xiang SD, McNally OM, Stephens AN, Quinn MA, Plebanski M. Immunotherapeutic Interleukin-6 or Interleukin-6 Receptor Blockade in Cancer: Challenges and Opportunities. Curr Med Chem. 2018;25(36):4785-4806.[3] Vecchi L, Mota STS, Zóia MAP, Martins IC, de Souza JB, Santos TG, Beserra AO, de Andrade VP, Goulart LR, Araújo TG. Interleukin-6 Signaling in Triple Negative Breast Cancer Cells Elicits the Annexin A1/Formyl Peptide Receptor 1 Axis and Affects the Tumor Microenvironment. Cells. 2022 May 20;11(10):1705.[4] Kooijman R, Himpe E, Potikanond S, Coppens A. Regulation of interleukin-8 expression in human prostate cancer cells by insulin-like growth factor-I and inflammatory cytokines. Growth Horm IGF Res. 2007 Oct;17(5):383-91.[5] Chelouche-Lev D, Miller CP, Tellez C, Ruiz M, Bar-Eli M, Price JE. Different signalling pathways regulate VEGF and IL-8 expression in breast cancer: implications for therapy. Eur J Cancer. 2004 Nov;40(16):2509-18.

2022-12-30 11:31:56繪制人類腫瘤微環(huán)境的空間圖譜: 介紹和目標(biāo)免疫系統(tǒng)對癌癥治療的反應(yīng)可以反映患者在治療之后是否會有良好的結(jié)果。了解腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤發(fā)生和治療反應(yīng)中的變化對制定個性化的治療方案并改善癌癥治療至關(guān)重要。借助穩(wěn)定和全面的超多標(biāo)成像技術(shù)，可使用免疫標(biāo)志物探查髓系和淋巴系細胞的譜系和結(jié)構(gòu)，而且結(jié)合特定腫瘤生物標(biāo)志物時，還可以捕捉多種腫瘤中TME內(nèi)的免疫反應(yīng)。細胞類型特征模式，結(jié)合超多標(biāo)組織成像的探查能力，可以針對免疫細胞群和TME內(nèi)眾多類型細胞的空間相互作用提供之前無法獲得的全新認(rèn)識。Cell DVE超多標(biāo)成像分析整體解決方案可以使用循環(huán)染色和染料失活流程對一個完整組織切片上的數(shù)十個生物標(biāo)志物進行檢測和成像。Cell DIVE的核心是一個精確、靈活、開放的多標(biāo)記成像解決方案，可以靈活選擇多標(biāo)記成像研究中常用的生物標(biāo)志物抗體。Cell Signaling Technology(CST)擁有豐富的經(jīng)IHC驗證的抗體組合，可檢測TME中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，實現(xiàn)組織中的免疫細胞檢測和表型判斷。CST提供抗體偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)物均經(jīng)過驗證，可用于Cell DIVE上，并提供經(jīng)IHC驗證抗體與熒光團和其他檢測試劑的定制化偶聯(lián)。CST采用嚴(yán)格的IHC驗證方法，隨后還會在Cell DIVE平臺上進行驗證，可確保成功檢測蛋白質(zhì)。在本研究中，我們展示了使用由數(shù)十種CST生物標(biāo)志物抗體?組成的新型檢測模式，在多種組織類型中進行的Cell DIVE超多標(biāo)成像。多標(biāo)記檢測模式的開發(fā)所需的優(yōu)化極少，可識別復(fù)雜的細胞類型，并揭示腫瘤微環(huán)境中的細胞間相互作用。結(jié) 果表征腫瘤微環(huán)境有助于理解導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的新機制。腫瘤微環(huán)境比較復(fù)雜，通常在單個樣本和不同患者樣本中都是異質(zhì)的。循環(huán)多標(biāo)記染色和成像可在不同組織樣本中實現(xiàn)TME探查，即使可用組織有限的情況下。在這項研究中，我們檢查了12個完整組織或TMA切片中30多個生物標(biāo)志物的表達（表1），重點是潛在的免疫治療目標(biāo)、預(yù)測性生物標(biāo)志物和分割標(biāo)志物。所有的CST生物標(biāo)志物抗體均被連接并隨機分配到一個回合。表1.研究設(shè)計：抗體和組織為了在TME中其他細胞的背景下定義免疫細胞，融合并分割了所有的生物標(biāo)志物圖像，并使用聚類分析和降維（UMAP）對表達進行分析。聚類分析提供了一個無偏見的方法來定義組織內(nèi)的免疫細胞貢獻。在這項研究中，我們展示了人類結(jié)腸腺癌（CAC；圖1）的聚類分析。在這里，聚類分析將白細胞從所有其他上皮細胞和基質(zhì)細胞類型中區(qū)分出來（圖1C）。此外，聚類清楚地定義了淋巴細胞和骨髓細胞類別。CAC中的骨髓類亞型包括骨髓祖細胞、M2巨噬細胞和另外兩個未知亞型的骨髓聚類。其他生物標(biāo)志物可用于進一步定義亞型。對于淋巴類，定義了T細胞和NKT細胞聚類。另外，還確定了一個具有CD20陽性的T細胞聚類。使用機器學(xué)習(xí)進行單細胞表型分析，可以從聚類中進一步定義細胞類型。例如，在圖像1D中，聚類15中的一個細胞是CD45+ CD3+ CD8+ CD4+ GRZB+ Ki67+ LAG3+ PD1+TIM3+（圖1D-E；橙色圈）。聚類和單細胞空間分析被應(yīng)用于研究中的所有其他組織（圖2；數(shù)據(jù)未顯示）。圖1：CST檢測模式的多標(biāo)成像可在一張玻片上檢查結(jié)腸腺癌（CAC）組織的免疫細胞成分（圖1 A）。用多種生物標(biāo)志物對玻片進行反復(fù)染色和成像（表1；圖1 A、B、D板）。使用全套30種生物標(biāo)志物進行分割后，聚類分析顯示了組織內(nèi)的免疫細胞（1C-H所示為CAC，正常結(jié)腸組織未顯示）。聚類15（圖1D-F）被突出顯示，一個跨生物標(biāo)志物的特定細胞用一個橙色的圓圈突出顯示（圖1D）。降維（UMAP；圖1G）表示免疫細胞和其他聚類之間的關(guān)系。圖2：CST檢測模式在多種癌癥和正常組織類型中的多標(biāo)成像。玻片被反復(fù)染色和成像（表1；圖2組織類型）。所有生物標(biāo)志物顯示在一張圖像中。使用全套30種生物標(biāo)志物進行分割后，聚類分析顯示了組織內(nèi)的免疫細胞（數(shù)據(jù)未顯示）。組織特定的免疫細胞聚類是由特定的生物標(biāo)志物表達模式統(tǒng)計出來的。在聚類之后，單細胞表型能夠?qū)垲愔械募毎哼M行空間分析。方法和材料CST抗體經(jīng)過了嚴(yán)格的驗證，以確保抗體在FFPE組織上的表現(xiàn)。本研究中的所有抗體都是直接偶聯(lián)或商業(yè)偶聯(lián)物成品（表1）。偶聯(lián)是使用非位點特異性化學(xué)方法進行的。抗體與四種不同的染料過量偶聯(lián)，去除未結(jié)合的染料，并通過分光光度分析測量標(biāo)記的程度。經(jīng)過初步驗證，具有最佳標(biāo)記程度和濃度的偶聯(lián)抗體溶液隨后用于對各種人類癌癥組織和正常組織的染色。組織從商業(yè)來源獲得（Pantomics；表1）。在Cell DIVE上使用四通道+DAPI對組織進行成像，并自動進行自發(fā)熒光去除、校正和拼接。使用徠卡顯微系統(tǒng)開發(fā)的專利軟件全拼接圖像進行導(dǎo)入、融合和分析。結(jié) 論使用Cell DIVE超多標(biāo)組織成像分析整體解決方案，用30多種CST生物標(biāo)志物抗體對12個完整的組織和TMA切片進行循環(huán)染色和成像。這個CST檢測模式能夠識別含有不同免疫類別、細胞類型和亞型的細胞的集群。Cell DIVE超多標(biāo)組織成像分析整體解決方案可保存組織，未來進一步定義免疫細胞亞型的工作可以繼續(xù)使用同一組織切片上的其他CST抗體，并與研究中所有先前的生物標(biāo)志物疊加。相關(guān)產(chǎn)品超多標(biāo)組織成像分析整體解決方案Cell DIVE

2023-03-20 14:23:30【THUNDER小課堂】腫瘤細胞中有絲分裂紡錘體的成像: 本文展示了如何使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）實現(xiàn)尤文（尤因）肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節(jié)觀察，從而協(xié)助本研究的進行?；罴毎上竦燃夹g(shù)在了解腫瘤進展和轉(zhuǎn)移研究中至關(guān)重要。真核細胞中的有絲分裂紡錘體由中空的微管組成。它在有絲分裂期間的細胞內(nèi)重復(fù)染色體分離和分裂細胞細胞骨架結(jié)構(gòu)的構(gòu)建過程中發(fā)揮著重要的作用。在尤文肉瘤這一類的腫瘤細胞中，有絲分裂障礙的觸發(fā)因子可通過檢查有絲分裂紡錘體的機能障礙來得以確認(rèn)。簡介使用熒光顯微鏡可以研究腫瘤形成和進展過程中組織及細胞內(nèi)部發(fā)生的變化。像活細胞成像這樣的技術(shù)對更加深入地了解腫瘤進展和轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的。在真核細胞中，由中空微管組成的有絲分裂紡錘體，有助于構(gòu)建復(fù)制細胞的細胞骨架結(jié)構(gòu)，并在有絲分裂過程中將復(fù)制的染色體從原始細胞中分離出來。在尤文肉瘤這一類的腫瘤細胞中，有絲分裂障礙的觸發(fā)因子可通過檢查有絲分裂紡錘體的機能障礙來得以確認(rèn)[1]。肉瘤是肌肉或骨骼等結(jié)締組織中形成的一類腫瘤。尤文肉瘤和橫紋肌肉瘤，分別生長于骨骼和肌肉中，是一種傾向于發(fā)生在骨骼生長活躍區(qū)域附近的兒科腫瘤。除了手術(shù)和化療之外，電離輻射也被用于治療這類腫瘤，但這可能會導(dǎo)致生長中的骨骼受到永jiu性損傷，包括不對稱生長停滯、脛骨畸形及骨折概率增加等。骨骼損傷的嚴(yán)重度在很大程度上與骨骼接受的輻射劑量成正比。因此，我們有理由認(rèn)為，選擇性放射致敏腫瘤組織的策略可降低實現(xiàn)局部控制所需的輻射劑量，并能最大限度降低對鄰近健康組織造成的間接損傷。運用體外研究和小鼠異種移植模型系統(tǒng)，對使用mRNA合成抑zhi劑光神霉素A預(yù)處理，可以通過改變輻射損傷的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)實現(xiàn)選擇性放射致敏EWS：Fli1+腫瘤細胞的假設(shè)進行了驗證[2]。結(jié)果表明，光神霉素A可以通過抑zhi參與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使EWS：Fli1+細胞在體內(nèi)外顯著放射增敏，導(dǎo)致腫瘤細胞程序性死亡[2]。使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）可以揭示肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節(jié)，協(xié)助癌癥研究人員獲得更有用的見解。挑戰(zhàn)在有絲分裂紡錘體成像中，可對其實現(xiàn)快速成像，并獲得清晰的高對比度3D成像，以清晰展示重要細節(jié)的解決方案最為實用。傳統(tǒng)的寬場顯微成像速度快，檢測靈敏度高，但不幸的是對于厚樣本的成像通常會出現(xiàn)失焦不清晰或模糊的情況，這會降低對比度[3]。要闡明有絲分裂的不穩(wěn)定性在癌癥等復(fù)雜疾病中的作用，這需要在同一樣本中進行多個關(guān)聯(lián)生物學(xué)標(biāo)記。方法該研究中使用了尤文肉瘤細胞（SK-ES-1）。對這些細胞進行α-微管蛋白（Clone YL1/2 Thermo-Fisher Scientific # MA1-80017，按1:500比例稀釋/ Dylight 488偶聯(lián)驢抗大鼠 Thermo-Fisher Scientific #SA5-10026）、γ-微管蛋白（Clone TU-30，AbCam # ab27074，按1:200比例稀釋/Dylight 550偶聯(lián)驢抗小鼠 Thermo-Fisher Scientific # SA5-10167）和DNA（Hoechst 33342藍）進行染色。染色后，使用介質(zhì)ProLong Glass Antifade（Thermo-Fisher Scientific #P36981）進行蓋玻片封片，并通過使用63×/1.4 NA（數(shù)值孔徑）的油鏡進行THUNDER Imager Tissue成像。圖像采集使用大體積成像解析（LVCC）[3]模式，并生成最大化投影圖像數(shù)據(jù)。結(jié)果在有絲分裂過程中，α-微管蛋白（綠色）形成有絲分裂紡錘體，染色單體（藍色）會附著在有絲分裂紡錘體上，而γ-微管蛋白（紅色）集中定位在分裂細胞中的紡錘極上。通過THUNDER技術(shù)可觀察到肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節(jié)。清晰的圖像可以展示清晰的結(jié)構(gòu)，以便進行分割和進一步的分析。圖1：尤文肉瘤細胞SK-ES-1 α-微管蛋白（綠色）、γ-微管蛋白（紅色）和DNA（藍色）染色后的最大化投影：原始圖像數(shù)據(jù)（左）和THUNDER LVCC模式成像數(shù)據(jù)（右）。結(jié) 論 THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[3]進行尤文肉瘤細胞中的有絲分裂紡錘體成像時可顯著增強對比度。與傳統(tǒng)的寬場成像相比，其可展示細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節(jié)。References：1.S. Rello-Varona, D. Herrero-Martín, L. Lagares-Tena, R. López-Alemany, N. Mulet-Margalef, J. Huertas-Martínez, S. Garcia-Monclús, X. García del Muro, C. Mu?oz-Pinedo, O. Martínez Tirado, The importance of being dead: cell death mechanisms assessment in anti-sarcoma therapy, Frontiers in Oncology (2015) vol. 5, p. 82, DOI: 10.3389/fonc.2015.00082.2.M. Yun Lin, T.A. Damron, M.E. Oest, J.A. Horton, Mithramycin A Radiosensitizes EWS:Fli1+ Ewing Sarcoma Cells by Inhibiting Double Strand Break Repair, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2021) vol. 109, iss. 5, pp. 1454-1471, DOI: 10.1016/j.ijrobp.2020.12.010.3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note : THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.相關(guān)產(chǎn)品THUNDER Imager Tissue全景組織顯微成像系統(tǒng)