游離脂肪酸（FFA）是嬰兒配方奶粉和牛奶中營養(yǎng)和風味成分不可或缺的一部分。除了作為能量來源外，F(xiàn)FA還充當脂溶性維生素（如A、D、E和K）的重要載體。此外，F(xiàn)FA還通過建立保護性脂肪層為嬰兒提供物理保護，同時促進視覺和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。
然而，脂質(zhì)在降解過程中會生成醛、酮和醇等物質(zhì)，這一降解過程又會產(chǎn)生一種令人不悅的“酸敗”風味2。此外，脂肪酸氧化還會導(dǎo)致乳制品適口性下降、品質(zhì)劣變。因此，對嬰兒配方奶粉和牛奶中的FFA進行系統(tǒng)性篩查至關(guān)重要，涵蓋了質(zhì)量控制（QC）、產(chǎn)品改進、認證和法規(guī)合規(guī)性等多種關(guān)鍵功能。
目前脂肪酸常用分析手段：
HPLC | 耗時，且需要極性相對較低的色譜柱 |
GC | 衍生，將脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯 （FAMES） |
UPCC | 無需衍生、快速且可拆分異構(gòu)體 |
LC-MS | 無需衍生，快速且專屬性強 |
沃特世基于ACQUITY QDa II質(zhì)譜檢測器開發(fā)的FFA分析方法，精簡且高效。
即開即用的質(zhì)譜，實時、定性和定量LC-MS方法開發(fā)；
可在不到6 min內(nèi)快速實現(xiàn)19種FFA(C8:0~C24:0)的色譜分離；
專屬性，利用質(zhì)量數(shù)信息區(qū)分保留時間相似但質(zhì)量數(shù)不同的化學組分；
高靈敏度和高重復(fù)性的方法。
表1. 液相色譜參數(shù)。
表2. 液相色譜梯度。
表3. MS參數(shù)。
用于分析的GLC參比標準品426(包含20種游離脂肪酸，范圍從C6:0到C24:0)購自Nu-Chek Prep(美國明尼蘇達州)。標準品中各組分的重量百分比范圍為2%~16%(表3)?；鞓酥懈鱂FA組分的濃度與真實樣品中的濃度相近。
表4. 混標中的游離脂肪酸。
將市售牛奶和嬰兒配方奶粉樣品用甲醇（MeOH）(1:5)稀釋，然后在10,000 g下離心5 min。得到的上清液用去離子水（1:5）進一步稀釋。然后用流動相A和B(1:1)稀釋溶液，并轉(zhuǎn)移到LC樣品瓶中進行LC-MS分析。
色譜條件篩選
由于烴鏈的長度和羧酸等官能團的存在，F(xiàn)FA的極性可能有所不同。碳原子數(shù)較少的短鏈FFA的極性通常較低，而碳原子數(shù)較多的長鏈FFA由于羧酸基團的存在，極性往往更高。本應(yīng)用中測試了三種ACQUITY UPLC色譜柱，分別為AX BEH C18、CSH C18和BEH苯基柱。使用BEH苯基柱時，在6 min的梯度內(nèi)，20種混合物組分（范圍從C8:0到C24:0）中有19種組分實現(xiàn)了理想的峰分離。
無論流動相B的組成如何，均可得出結(jié)論：流動相A中的1 mM甲酸銨水溶液（NH4HCO4）對于電離樣品中的FFA至關(guān)重要。濃度高于1 mM的NH4HCO4會顯著降低信號強度（圖1）。
圖1. 當在流動相A中使用2 mM NH4HCO4（紅色）代替1 mM NH4HCO4（綠色）作為添加劑時，信號強度減少了五倍。每次測試的柱上混標上樣量為10 ng。
測試了甲醇、乙腈和異丙醇，最終的方法條件是以ACN作為流動相B，因為這樣對于混標中的大多數(shù)FFA而言，該方法的峰分離效果良好、靈敏度較高，定量下限（LLOQ）<10 pg/μL(ppb)，對應(yīng)于嬰兒配方奶粉或牛奶樣品中的0.01 mg/L(表7)。
為使游離脂肪酸（FFA）從LC色譜柱上有效洗脫，需要采用高有機相條件。當將流動相B%由55%提升至90%時，所有化合物在1分鐘內(nèi)迅速從色譜柱中洗脫出來。與之相比，采用從55%逐步過渡至80%的梯度條件則獲得了理想結(jié)果，實現(xiàn)了良好的峰分離效果（圖2）。這種優(yōu)化的峰分離為混合物中各FFA的單離子掃描（SIR）采集模式應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。具體實施方法是將采集方法劃分為5個獨立的SIR時間窗口，每個窗口涵蓋3~5種不同的FFA組分。
圖2. FFA混標的峰分離需要使用有機相從高逐漸到低的梯度。FFA標準品的柱上進樣量分別為最高10 ng和最低5 ng。
圖3展示了為FFA分析選擇的最終LC-MS方法獲得的色譜圖。在評估一系列方法開發(fā)因素后，確定以1 mM NH4HCO4水溶液和ACN分別作為流動相A和B，并在BEH苯基柱上以B%從55%~80%為梯度（表1和表2）。
圖3. 使用包含所有19種目標FFA的五個不同時間窗口進行的SIR采集。每個SIR窗口和FFA峰以不同顏色和字母突出顯示。
靈敏度和重現(xiàn)性評估
此外，該方法對所有濃度低于10 pg/μL的FFA組分均表現(xiàn)出高靈敏度，并在高濃度和低濃度條件下均具有良好的重現(xiàn)性，所有組分的%RSD均在0.3%~8.2%之間。
表5. 混標中19種FFA組分的重復(fù)性數(shù)據(jù)。ppb濃度的差異反映了混標中的豐度相對百分比。*二十四烷酸的%RSD較高可以用臨近運行結(jié)束時的化學噪音增加來解釋。
定量下限（LLOQ）確定為20:1 S/N(通過均方根（RMS）計算)，以及峰面積達到空白響應(yīng)的五倍。
表6. 混合物中19種FFA組分的LLOQ。*在硬脂酸中觀察到峰干擾。
使用基質(zhì)樣品進行初步方法驗證
為評估此方法的適用性，我們評估了選定的基質(zhì)樣品（圖4）。牛奶和嬰兒配方奶粉樣品中的FFA采用簡單的甲醇萃取法進行萃取，并在LC-MS分析前用流動相A和B進一步稀釋（1:1）。盡管在牛奶和嬰兒配方奶粉中，F(xiàn)FA在脂肪中所占的比例不到2%，均能檢出，且FFA濃度結(jié)果與制造商和文獻報道的水平一致5,6。
圖4. 方法性能在真實樣品中的示例。A)混標中1.6 pg/μL的棕櫚酸；B)嬰兒配方奶粉中13.3 ng/μL的棕櫚酸；C)混標中4 pg/μL的月桂酸；D)全脂牛奶中3.7 ng/μL的月桂酸。
該方法展示了在FFA快速、高樣品通量分析（每天最多可分析240個樣品）中的適用性。
綜上，將ACQUITY I-Class UPLC與
ACQUITY QDa II質(zhì)譜檢測器聯(lián)用，并結(jié)合ACQUITY UPLC BEH苯基柱的創(chuàng)新分析方法，在游離脂肪酸分析方面展現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢。
該方法不僅可以確保在六分鐘內(nèi)快速準確地分離從C8:0到C24:0的各種FFA，還可以為實驗室?guī)頋撛诘膶嵸|(zhì)性益處，例如顯著節(jié)省成本，同時大幅簡化了復(fù)雜的操作步驟。
此外，該方法還可以節(jié)省大量時間（典型的GC-MS分析中，每個樣品通常需要20分鐘至1小時），幫助研究人員提高生產(chǎn)力和通量，從而提高實驗室的運營效率。集速度、靈敏度和簡便性于一身。
參考資料
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