腸道是人體重要的消化器官,腸指的是從胃幽門(mén)至肛門(mén)的消化管, 是消化器官中最長(zhǎng)管道，人體腸道結(jié)構(gòu)主要包括小腸和大腸。腸道疾病非常常見(jiàn)，如腸梗阻、慢性炎癥性腸病、結(jié)直腸癌等等，其中結(jié)直腸癌已成為威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一。因此，腸道的研究是現(xiàn)在非常熱門(mén)的領(lǐng)域，有著廣闊的應(yīng)用前景。

2009年，Hans Clevers研究團(tuán)隊(duì)利用來(lái)源于腸隱窩的單個(gè)干細(xì)胞（Lgr5+）或單個(gè)隱窩結(jié)構(gòu)，首次在體外成功培養(yǎng)出3D腸道“類器官”。離體的腸道干細(xì)胞或隱窩在基質(zhì)膠、小分子化合物、細(xì)胞添加劑以及多種生長(zhǎng)因子中培養(yǎng)可不斷增殖，具有自我更新及分化能力，能夠分化形成多種腸道成熟細(xì)胞，在腸道疾病模型建立和研究中發(fā)揮重要的作用。^[1]

圖1. 單細(xì)胞在單孔中的集落形成效率^[1]

1. 隱窩分離，細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)

通常在含有2 mM EDTA的PBS中，4℃下孵育30 min，從小鼠小腸中釋放隱窩。對(duì)分離的隱窩進(jìn)行計(jì)數(shù)并成球。在24孔板中，加入基質(zhì)膠、生長(zhǎng)因子（10-50 ng/mL EGF、500 ng/mL R-spondin 1、100 ng/mL Noggin）孵育。

2. 分選實(shí)驗(yàn)

分離的隱窩37℃孵育45 min，分離后的細(xì)胞通過(guò)孔徑為20 μm的細(xì)胞過(guò)濾器。將分選的細(xì)胞收集在隱窩培養(yǎng)基中，并加入含有Jagged-1多肽（1 μM）的基質(zhì)膠中，每孔1個(gè)細(xì)胞（在96孔板中，含5 mL基質(zhì)膠）。

3. 隱窩培養(yǎng)基

48孔板加入250 μL培養(yǎng)基，96孔板100 μL培養(yǎng)基，并且添加小分子化合物Y-27632（10 μM），每隔一天添加一次生長(zhǎng)因子，每4天更換一次培養(yǎng)基。

4. 傳代

將類器官?gòu)幕|(zhì)膠中取出，機(jī)械分離成單隱窩結(jié)構(gòu)域，然后轉(zhuǎn)移到新鮮的基質(zhì)膠中。每1-2周進(jìn)行一次，分割比例為1：5。^[1]

 圖2. 腸隱窩培養(yǎng)系統(tǒng)的建立^[1]

 圖3. b、c、d分別為培養(yǎng)第5天、14天、3周后的情況，e為隱窩樣器官的示意圖^[1]

在培養(yǎng)小鼠結(jié)腸類器官時(shí)，培養(yǎng)基中需要添加p38 MAPK激酶抑制劑（SB-202190）、TGF-β抑制劑（A 83-01）、Rho激酶抑制劑（Y-27632）和GSK抑制劑（CHIR-99021）、Jagged-1等小分子化合物，以及EGF、R-spondin-1、Noggin和Wnt-3A等生長(zhǎng)因子。^[1] [2] 

研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)需求來(lái)設(shè)計(jì)的這樣一個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)，Wnt信號(hào)傳遞是隱窩增殖的關(guān)鍵要求，而Wnt激動(dòng)劑R-spondin1在體內(nèi)誘導(dǎo)隱窩明顯增生，表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與腸道增殖有關(guān)，Noggin的轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)了隱窩數(shù)量的增加。Rho激酶抑制劑Y-27632抑制胚胎干細(xì)胞失巢凋亡，降低細(xì)胞死亡率。細(xì)胞間的Notch信號(hào)對(duì)于維持隱窩的增殖至關(guān)重要，我們還提供了一種Notch激動(dòng)性肽（Jagged-1）。^[1] [2]

2022年Hans Clevers團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地引入了IL-22來(lái)優(yōu)化hSIOs培養(yǎng)基組成，極大地提高了腸道類器官的出芽比例，上調(diào)潘氏細(xì)胞的表達(dá)水平，更好地模擬人體內(nèi)腸道的組成性表達(dá)成分。如下圖。

圖4.人結(jié)腸培養(yǎng)（小分子化合物Nicotinamide、SB 202190和A 83-01對(duì)培養(yǎng)的影響）^[2]

 圖5.人結(jié)腸腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程^[2]

類器官培養(yǎng)和藥物刺激的hSIO培養(yǎng)基中需要添加的小分子化合物、添加劑和細(xì)胞因子，分別為：B-27（1%），N-乙酰半胱氨酸（1 mM），煙酰胺（10 mM），Alk 4/5/7抑制劑A 83-01（500 nM）, p38抑制劑SB 202190（3-10 μM），前列腺素E2（10 nM），CHIR-99021（3-10 μM），Rho激酶抑制劑Y-27632二鹽酸鹽（10 μM）和Primocin（100 μg/mL），BP-1-102，LY294002，MK-2206，雷帕霉素，N-2，谷氨酰胺，HEPES，青霉素/鏈霉素，R-Spondin，Noggin（2%）,人EGF（50 ng/mL），人IL-22（2 ng/mL），具體如下圖所示（圖六）。^[3]

1.重懸隱窩基質(zhì)膠混合物，孔板中加入一定量的混合物和隱窩培養(yǎng)基（如24孔板可加入50 μL混合物和500 μL培養(yǎng)基）；
2.用離心管轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)里，PBS（含雙抗）潤(rùn)洗2-3次，將腸粘膜轉(zhuǎn)移至含有EDTA（2 mM）的溶液中，置于4℃，小腸消化約30 min，結(jié)腸消化約1 h；
3.將消化好的小腸粘膜轉(zhuǎn)移至離心管中，加入PBS，搖晃均勻后用70 μm的細(xì)胞過(guò)濾篩過(guò)濾，1000 r/min室溫離心5 min，結(jié)腸隱窩無(wú)需過(guò)濾；
4.棄上清，加入培養(yǎng)基重懸沉淀，計(jì)數(shù)，隱窩的數(shù)量約10個(gè)/μL為佳；
5.加入一定量的懸液到離心管中，室溫離心5 min；
6.加入預(yù)冷的基質(zhì)膠混合物（基質(zhì)膠：培養(yǎng)基為2:1）重懸沉淀；
7.將重懸液按一定量接種在預(yù)熱的孔板中；

8.每個(gè)孔加入一定量的預(yù)熱的隱窩培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1-2周。

9.在培養(yǎng)板中，每孔加入一定量的培養(yǎng)基，用槍頭將基質(zhì)膠小心的刮出，取懸液，轉(zhuǎn)移到離心管中；
10.將要傳代的隱窩置于冰上5-10 min；
11.用槍頭吹打基質(zhì)膠，反復(fù)進(jìn)行，直至基質(zhì)膠被打碎，中間盡量避免氣泡產(chǎn)生；

12.將消化好的小腸粘膜轉(zhuǎn)移至離心管中，加入PBS，搖晃均勻后用70 μm的細(xì)胞過(guò)濾篩過(guò)濾，1000 r/min室溫離心5 min，結(jié)腸隱窩無(wú)需過(guò)濾；

13.棄上清，加入培養(yǎng)基重懸沉淀，計(jì)數(shù)，隱窩的數(shù)量約10個(gè)/μL為佳；

14.加入一定量的懸液到離心管中，室溫離心5 min；

15.加入預(yù)冷的基質(zhì)膠混合物（基質(zhì)膠：培養(yǎng)基為2:1）重懸沉淀；

16.可按1：1 - 3：1進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

17.將需要凍存的類器官置于冰上5-10 min；
18.收集類器官，離心后棄上清；
19.加入凍存培養(yǎng)液重懸類器官，分裝至凍存管中，置于-80℃，24 h后置于液氮中長(zhǎng)期保存。

利用腸類器官構(gòu)建的體外腸道模型，可以極大的推動(dòng)對(duì)腸道疾病發(fā)生發(fā)展的研究，為高通量藥物篩選、新物研發(fā)、藥物功能檢測(cè)、靶向治療、個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療、再生醫(yī)學(xué)提供新的重要的研究平臺(tái)和途徑。腸道類器官的出現(xiàn)，為腸道疾病的研究和治療打開(kāi)了一扇全新的大門(mén)。

[1] Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5. doi: 10.1038/nature07935. Epub 2009 Mar 29. PMID: 19329995.

[2] Sato T, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 2011 Nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 Sep 2. PMID: 21889923.

[3] He GW, et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell. 2022 Sep 1;29(9):1333-1345.e6. doi: 10.1016/j.stem.2022.08.002. Epub 2022 Aug 23. Erratum in: Cell Stem Cell. 2022 Dec 1;29(12):1718-1720. PMID: 36002022; PMCID: PMC9438971.