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  xpgsldf 2016-11-13 00:00:00

  （一）從源頭控制污染： （1）玻璃制品、塑料制品和電泳槽 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不經(jīng)預處理直接用于制備和貯存RNA。實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經(jīng)常有RNA酶法染，使用前必須于180 ℃干烤8小時或更長時間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強烈YZ劑，但其作用并不是的（Fedorcsak和Ehrenberg，1966）。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次， 并于100℃干烤15分鐘（Kumar和Lindberg，1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。 　　用于RNA電泳的電泳槽應用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3％的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 ％DEPC處理過的水徹底沖洗電泳槽。Z好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標記，存放在指定地點，為RNA實驗專用。 （2）研究人員造成的污染 RNA酶Z主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準備分離的和分析RNA的材料和溶液時，主有涉及RNA的一切操作過程中，都應戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進行RNA實驗時應勤換手套。 （3）污染的溶液 用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿?？赡艿脑捜芤壕鶓?.1％DEPC于37℃至少處理12小時，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。注：DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學反應，因些不能用來處理含有Tris 一類的緩沖液。可存幾瓶新的未開封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。 （二）已經(jīng)污染，可以加入RNA酶的YZ劑 （1）RNA酶的蛋白質YZ劑是 從人胎盤分離的一種蛋白質可與多種RNA酶緊密結合（KI≈3x1010）形成非共價結合的等摩爾復合物，使RNA酶失活。此蛋白質體內(nèi)可能是血管生成素的YZ劑，血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結構與胰RNA酶類似的一種血管生成因子， 幾個廠家以不同的商品名出售這種YZ劑，該蛋白質應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。YZ劑制品凍融數(shù)次后或放置在氧化條件下即應棄之不用，因為上述處理會使蛋白質變性從而釋放出所結合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動物(mammal;mammalian)細胞這一提取RNA的初始步聚中不應使用這種蛋白YZ劑。然而職用更溫和的裂解方法時應使用這種YZ劑，并且在后續(xù)的所有RNA純化步驟中均應有此蛋白質存在。由于酚抽提可以除蛋白質YZ劑，故應在純化過程中補加幾次YZ劑。其Z大活性的發(fā)揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯。 （2）氧釩核糖核苷復合物 這種由氧釩（1V）離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復合物，是量種過渡態(tài)類似物，它能與多種RNA酶結合并幾科能地YZRNA酶的活性。這4種氧釩核糖核苷復合物可加入完整細胞中，在RNA提取和純化的所有過程中，其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細胞中進行翻譯， 并能作為某些外酶促反應（如mRNA反轉錄）的模板。然而氧釩核糖核苷復合物強烈YZmRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1 ％羥基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷復合物。 （3）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就發(fā)現(xiàn)它能吸附RNA酶，用緩沖液將其制成漿液，以0.015％（W/V）的終濃度溶解細胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續(xù)的RNA純化過程中（如酚抽提后）經(jīng)離心去除。 （三）提取核酸時可以加入鹽酸胍或硫氰酸胍溶液。鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質，從而免受RNA酶的干擾。

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