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流式熒光抗體染色相關(guān)問(wèn)題 解決方案

本文由 上海索寶生物科技有限公司 整理匯編

2018-09-02 10:00 5624閱讀次數(shù)

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無(wú)法標(biāo)記細(xì)胞1、抗體是否正確保存(4攝氏度避光保存);2、抗體是否超過(guò)使用期限;3、樣品中是否加入了正確的抗體(一抗或二抗);4、確??贵w結(jié)合了熒光物質(zhì)。如果抗體未結(jié)合熒光染料,確保使用了適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記二抗;5、確保二抗有活性是否曾與其它一抗聯(lián)合使用?6、使用的二抗是否能識(shí)別所用一抗;7、PE或APC標(biāo)記的抗體,確保產(chǎn)品未冷存;8、確定樣品是否表達(dá)要檢測(cè)的抗原。建議設(shè)一組已知表達(dá)改抗原的樣品作為陽(yáng)性對(duì)照;9、樣品種屬與抗體是否匹配。10、確保使用正確波長(zhǎng)的激發(fā)光及正確的分析通道。熒光強(qiáng)度弱1、可能是過(guò)度稀釋抗體。請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)正確稀釋抗體;2、間接染色中造成弱陽(yáng)性的原因可能是前帶效應(yīng),即高濃度抗體聚集阻礙特異性抗體和抗原的結(jié)合,可能會(huì)引起弱的染色結(jié)果。解決方法:稀釋抗體;3、細(xì)胞數(shù)過(guò)多也會(huì)引起弱陽(yáng)性結(jié)果。調(diào)整細(xì)胞至說(shuō)明書(shū)建議密度;4、可能與抗原表達(dá)情況有關(guān)。請(qǐng)檢查相關(guān)文獻(xiàn)以確定抗原表達(dá)水平;5、若抗原表達(dá)弱,請(qǐng)選擇熒光強(qiáng)度高的熒光標(biāo)記抗體;6、使用有交叉反應(yīng)的抗體比特異性抗體更易出現(xiàn)弱陽(yáng)性結(jié)果;7、優(yōu)化一抗和二抗的孵育時(shí)間及溫度。非特異性染色1、非特異性染色,可能是由于自發(fā)熒光引起的。解決方法:在同樣的檢測(cè)條件下,加入空白細(xì)胞對(duì)照,可得出細(xì)胞自發(fā)熒光的水平。2、選擇CD16/32抗體(SG產(chǎn)品編號(hào):M10161)封閉Fc受體,可減少抗體和細(xì)胞的非特異性結(jié)合。3、可能是使用二抗引起的非特異性染色。請(qǐng)選擇與檢測(cè)組織沒(méi)有交叉反應(yīng)的二抗。4、染色后是否充分洗滌。5、降低抗體濃度,可減少非特異性染色。同一抗體,PE標(biāo)記染不上,F(xiàn)ITC標(biāo)記的染色結(jié)果良好1、PE標(biāo)記的抗體是否被冷存。如果是此種情況,建議購(gòu)買新抗體;2、可能是多聚甲醛固定引起的問(wèn)題。請(qǐng)使用現(xiàn)配的多聚甲醛或?qū)⒓?xì)胞處理后不經(jīng)固定盡快分析。散射信號(hào)異常1、確保盡可能使用新鮮的細(xì)胞。散射光信號(hào)會(huì)顯示出死細(xì)胞和細(xì)胞碎片;2、刺激細(xì)胞會(huì)影響細(xì)胞的散射信號(hào);3、如果在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用了裂解液,請(qǐng)確保裂解液新鮮并且配置方法正確。結(jié)果不符合預(yù)期1、有些試劑可能會(huì)對(duì)某些特定抗原產(chǎn)生影響。例如:EDTA會(huì)影響某些血小板表面標(biāo)志分子;2、裂解液也可能會(huì)影響某些抗原的表位。請(qǐng)選擇不會(huì)干擾抗原檢測(cè)的裂解方式;3、檢測(cè)某些胞內(nèi)表達(dá)的抗原時(shí),需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜處理。上海索來(lái)寶021-54100800

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