共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡相比，具有高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點(diǎn)。隨著軟件開發(fā)和應(yīng)用技術(shù)的完善，共聚焦顯微鏡已成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。

共聚焦顯微鏡的樣品制備

　　共聚焦顯微鏡樣品制備是檢測(cè)前的關(guān)鍵步驟。樣品需經(jīng)熒光探劑標(biāo)記(單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo))。

　　標(biāo)本可以是固定的或活的組織，也可以是固定的或活的貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在Confocal專用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上，懸浮細(xì)胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片。樣品的Zda厚度約1~2mm，使用的蓋玻片厚度應(yīng)小于0.17mm，載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間，而且表面光潔，厚度均勻，沒有明顯的干擾熒光。固定樣品常用封片劑進(jìn)行封片，常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。

　　常規(guī)樣品制備要求：

　　1、染料的選擇

　　由于共聚焦顯微鏡是以單一波長的激光作為光源，因此在選擇熒光染料時(shí)要根據(jù)共聚焦顯微鏡配備的激光器波長選擇，如果在同一樣品中有多種熒光染料標(biāo)記，還要考慮它們的發(fā)射波長盡量不要重疊，避免串色問題。

　　2、樣品承載物的選擇

　　一般的共聚焦顯微鏡高倍物鏡均為油鏡，它的數(shù)值孔徑較小，要求鏡頭與樣品之間的工作距離不大于0.17mm，因此如果觀察樣品為貼壁細(xì)胞或組織切片，可以用普通的載玻片和蓋玻片即可。如果是懸浮細(xì)胞或懸浮粒子，可以用共聚焦顯微鏡專用的培養(yǎng)皿承載樣品進(jìn)行觀察。

　　3、封片劑的選擇

　　如果樣品只需要觀測(cè)一次并且不是極易淬滅的熒光，可以選用一定濃度的甘油混合液封片即可。如果樣品需要放置一段時(shí)間并多次拍攝，應(yīng)選用抗熒光淬滅的封片劑，以減少熒光信號(hào)丟失。

徠卡 共聚焦顯微鏡 STELLARIS

共聚焦顯微鏡的操作步驟

　?、俑鶕?jù)熒光探針的激發(fā)波長和發(fā)射波長，選擇合適的激光器、激光功率，分光鏡濾片和發(fā)射濾片。

　?、诖_定掃描方式：點(diǎn)、線、面、三維掃描。

　?、鄞_定掃描密度(分辨率):256×256、512×512、1024×1024、2048×2048，分辨率越高，掃描速度越慢，圖像信噪比越好，但也越容易發(fā)生光漂白。

　?、苓x取共聚焦顯微鏡物鏡的倍數(shù)及電子放大倍數(shù):這個(gè)條件被確定后，掃描范圍即被確定，物鏡的光透射率與數(shù)值孔徑(NA)的4次方成正比，與物鏡的放大倍數(shù)的平方成反比，因此，應(yīng)盡量選擇高數(shù)值孔徑的物鏡。

　?、莞鶕?jù)樣品的制備質(zhì)量選擇合適的針孔大小，調(diào)整激光管電壓、光電倍增管功率、降噪等至Z佳狀態(tài)，這些參數(shù)選擇或設(shè)置有非常密切的關(guān)系，選擇時(shí)應(yīng)綜合考慮。

　?、薮_定光切范圍，即掃描樣品的厚度，鎖定起始位置和結(jié)束位置。

　?、呓o出光切的層數(shù)及取圖時(shí)累計(jì)平均次數(shù)。

　?、喃@取圖像并保存。

共聚焦顯微鏡使用注意事項(xiàng)

　　使用共聚焦顯微鏡，必須注意以下幾點(diǎn)：

　?、賴?yán)格按照使用規(guī)程操作，不得任意改變操作程序，共聚焦顯微鏡中的激光發(fā)射管使用壽命有限且價(jià)格昂貴。所以，在操作使用過程中切記，在開關(guān)的啟動(dòng)順序以及在掃描過程中努力做到保護(hù)好激光管。

　　②注意不要暴露在中等功率和高功率的激光輻射中，特別要注意不得注視激光束，甚至不要觀看樣品：不得在共聚焦顯微鏡附近儲(chǔ)存或使用易燃易爆物的同體、液體或氣體：可以引燃的材料如布或紙張不得放入光路中。

　?、坶_機(jī)或改變激光功率后，約需20min激光光源才能夠達(dá)到穩(wěn)定，關(guān)閉共聚焦顯微鏡系統(tǒng)時(shí)，先關(guān)閉計(jì)算機(jī)，等氬離予激光器風(fēng)扇關(guān)閉時(shí)，方可關(guān)閉系統(tǒng)開關(guān)。

　?、軖呙韬蟮膱D像儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)內(nèi)，可作進(jìn)一步處理。由于計(jì)算機(jī)的硬盤有限，應(yīng)及時(shí)儲(chǔ)存到用戶軟盤上，但要警惕任何病毒浸染激光共聚焦顯微系統(tǒng)。使用前要嚴(yán)格把關(guān)，檢查軟盤是否攜帶病毒。

共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的日常管理

　　共聚焦顯微鏡作為使用率極高的大型精密儀器，它的正常運(yùn)轉(zhuǎn)離不開科學(xué)的日常管理。

　　1、負(fù)責(zé)人管理制度

　　為共聚焦顯微鏡指定儀器負(fù)責(zé)人，由專人負(fù)責(zé)儀器的開關(guān)機(jī)，規(guī)范的開關(guān)機(jī)對(duì)于共聚焦顯微鏡，尤其是激光器及汞燈的維護(hù)極為重要，并由負(fù)責(zé)人每天檢查儀器的運(yùn)行狀態(tài)。

　　2、儀器預(yù)約使用

　　激光器和汞燈均屬于耗材性的配件，使用壽命有限。尤其是激光器，價(jià)格昂貴，在幾萬至幾十萬元不等。充分利用好儀器的開機(jī)時(shí)間，避免共聚焦顯微鏡空轉(zhuǎn)顯得格外重要。一旦出現(xiàn)超過半小時(shí)以上的空檔時(shí)間，由共聚焦顯微鏡負(fù)責(zé)人及時(shí)協(xié)調(diào)儀器使用，通知預(yù)約較晚時(shí)間點(diǎn)的人員提前使用，避免共聚焦顯微鏡開機(jī)空轉(zhuǎn)造成的浪費(fèi)。

　　3、使用光盤或者網(wǎng)盤保存數(shù)據(jù)

　　嚴(yán)禁插拔U盤或者硬盤拷貝數(shù)據(jù)，使用儀器共享管理系統(tǒng)的網(wǎng)盤傳輸或者光盤刻錄數(shù)據(jù)結(jié)果，杜絕病毒侵染共聚焦顯微鏡系統(tǒng)。