共聚焦顯微鏡可以進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)定位、立體結(jié)構(gòu)重組、動(dòng)態(tài)變化過(guò)程等研究，并能提供定量熒光測(cè)定、定性圖像分析等研究手段，結(jié)合其他相關(guān)生物技術(shù)，在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。

共聚焦顯微鏡的結(jié)構(gòu)

　　傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾。而共聚焦顯微鏡則在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上利用激光作為光源，采用共軛聚焦裝置，并利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀察分析對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖像處理的一套觀察和分析系統(tǒng)。

　　共聚焦顯微鏡主要組成包括：顯微鏡、激光光源、掃描裝置、檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(包括數(shù)據(jù)采集，處理，轉(zhuǎn)換，應(yīng)用軟件)、圖像輸出設(shè)備、光學(xué)裝置和共聚焦系統(tǒng)。

　　1、激光器：隨著激光技術(shù)的飛速發(fā)展，共聚焦顯微鏡可以根據(jù)研究需要選擇不同的激光器、如：R-HeNe(633nm)、ArUV(351、364nm)、HeCd(442nm)、AR(458、477、488、514nm)、ArKr(488、568、647nm)、Kr(568nm)、G-HeNe(543nm)、Diode(405nm)等。

　　2、照明針孔：照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的。激光經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源，相干性好，頻率、振動(dòng)方向、相位高度一致。

　　3、光束分離器：從樣晶上反射和散射的光與熒光束混合在一起，所以需要用光束分離器將激發(fā)和釋放光束分開(kāi)。

　　4、物鏡：選大數(shù)值孔徑平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡為好，有利于熒光的采集以獲得更清晰的成像。

　　5、焦平面：激光點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面處聚焦，激發(fā)熒光標(biāo)記的樣本發(fā)射熒光，形成焦點(diǎn)光斑。該光斑經(jīng)過(guò)物鏡、光束分離器等一系列裝置的處理，分別在照明針孔及探測(cè)器針孔兩處聚焦，共聚焦的含義由此而來(lái)。

　　6、探測(cè)器針孔：起到空間濾波器的作用。Zda限度地阻礙非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦點(diǎn)斑以外的散射光，以保證探測(cè)器針孔所接受到的熒光信號(hào)全部來(lái)自于樣品光斑焦點(diǎn)位置，因此樣品上衍射聚集光斑和探測(cè)器針孔成像光斑包含相同信息。

　　7、探測(cè)器：用光靈敏度極高、響應(yīng)速度極快的電倍增管(PMT)檢測(cè)激發(fā)熒光，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。

徠卡 共聚焦顯微鏡平臺(tái) STELLARIS 5 & STELLARIS 8

共聚焦顯微鏡的特點(diǎn)

　　與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡有以下優(yōu)勢(shì)：

　　1、點(diǎn)光源：

　　傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡以自然光或內(nèi)置光等場(chǎng)光源作為光源，光譜范圍廣，標(biāo)本上的點(diǎn)會(huì)受到臨近的色散光和衍射光的干擾，使圖像的分辨率和對(duì)比度降低，而且像的邊緣常常帶有光暈。

　　共聚焦顯微鏡以激光作為光源，相干性好、方向性強(qiáng)、亮度高;激光前的光柵針孔能過(guò)濾激光，使其形成一個(gè)精細(xì)的光點(diǎn)，對(duì)樣品進(jìn)行單層掃面，有效消除了球差和色差。

　　2、共聚焦技術(shù)：

　　普通光學(xué)顯微鏡收集的光為來(lái)自焦平面上下的非測(cè)量光以及樣品反射光、衍射光的疊加，分辨率較低。

　　共聚焦顯微鏡利用共聚焦原理，將焦平面上非測(cè)量光點(diǎn)形成的雜散光和樣品不同焦平面的反射光、衍射光過(guò)濾，只使焦平面的光穿過(guò)檢測(cè)針孔，大大提高了圖像質(zhì)量。

　　3、三維成像：

　　光學(xué)顯微鏡為減少非測(cè)量光的干擾，對(duì)切片厚度要求較高，制樣過(guò)程較為復(fù)雜。并且只能形成平面像。

　　共聚焦顯微鏡同時(shí)具有橫向分辨率(0.2~0.25μm)和縱向分辨率(0.5~0.6μm)，通過(guò)控制載物臺(tái)橫縱向移動(dòng)，可實(shí)現(xiàn)樣品的逐點(diǎn)、逐面、逐層掃描，直接觀察標(biāo)本的不同剖面的細(xì)微結(jié)構(gòu)，形成立體圖像。

共聚焦顯微鏡作用

　　共聚焦顯微鏡是近代生物醫(yī)學(xué)圖像儀器Z重要的發(fā)明之一。以激光為光源，在傳統(tǒng)的熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，并利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，將光學(xué)成像的分辨率提高了30% ～40%。經(jīng)過(guò)處理后，可以觀察到細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的熒光圖像，并對(duì)樣品開(kāi)展全面、細(xì)致的研究。

　　目前，共聚焦顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用主要有以下方面: ①定量熒光測(cè)量; ②定量共聚焦圖像分析; ③三維重組分析生物結(jié)構(gòu); ④動(dòng)態(tài)熒光測(cè)定; ⑤熒光光漂白回復(fù)測(cè)定活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)等。

　　共聚焦顯微鏡主要用于具有熒光樣品的測(cè)定，因此對(duì)于沒(méi)有自發(fā)熒光的生物樣品，就需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，使其具有熒光標(biāo)記，再進(jìn)行檢測(cè)。能否用共聚焦顯微鏡順利地觀察到樣品的熒光圖像以及觀察到圖像質(zhì)量的好壞，在很大程度上取決于樣品的前處理技術(shù)。因此，對(duì)樣品進(jìn)行的前處理應(yīng)該具有熒光標(biāo)記反應(yīng)特異性強(qiáng)，熒光定位準(zhǔn)確、強(qiáng)度適宜，不破壞樣品的結(jié)構(gòu)、形態(tài)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)干擾等特征。此外，還應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)材料、試驗(yàn)?zāi)康摹⑿铏z測(cè)的指標(biāo)等確定合適的樣品前處理技術(shù)。