免疫印跡法就是將蛋白質(zhì)往膜上轉(zhuǎn)移，之后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。能夠使用相應(yīng)抗體作為一抗對(duì)已知表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，能夠通過(guò)融合部分的抗體對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

操作步驟

一、獲取蛋白質(zhì)樣品：

細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，能夠通過(guò)電泳上樣緩沖液將細(xì)胞直接裂解，將勻漿緩沖液加在真核細(xì)胞上，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1分鐘。之后4攝氏度下13,000g離心15分鐘，取上清液作為樣品。

二、電泳：

對(duì)電泳凝膠進(jìn)行制備，進(jìn)行SDS-PAGE。

三轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）

1、完成電泳后將膠條切成合適大小，使用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，分別進(jìn)行3次，每次5分鐘。

2、膜處理：將與膠條同樣大小的濾紙和NC膜預(yù)先裁好，將其在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸沒10分鐘。

3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置按照從下至上的順序依次將陽(yáng)極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板放好，精確對(duì)齊濾紙、凝膠、NC膜，每一步均將氣泡去除，將500g重物壓上，吸干碳板上多余的液體。將電源接通，恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。完成轉(zhuǎn)移后，將電源斷開，取出膜，對(duì)待測(cè)膜條割取來(lái)做免疫印跡。在膜染色液中放入有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色50秒之后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干，保存在兩層濾紙之間，和顯色結(jié)果對(duì)比。

四免疫反應(yīng)：

1、洗膜使用0.01M PBS進(jìn)行清洗，每次5分鐘，一共3次。

2.將包被液加入加入，室溫下保持2小時(shí)。

3.將包被液棄掉，洗膜使用0.01M PBS進(jìn)行清洗，每次5分鐘，一共3次。

4.將一抗加入（用0.01M PBS根據(jù)合適稀釋比例進(jìn)行稀釋，膜必須全部為液體所覆蓋），在4攝氏度下放置超過(guò)12小時(shí)，陰性對(duì)照，一抗使用1%BSA替代，其余步驟和實(shí)驗(yàn)組一樣。

5.將1%BSA和一抗棄掉。膜使用0.01M PBS分別進(jìn)行清洗，每次5分鐘，一共4次。

6、將辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗加入（用0.01M PBS根據(jù)合適稀釋比例進(jìn)行稀釋），平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫下保持兩個(gè)小時(shí)。

7、將二抗棄掉，膜使用0.01M PBS進(jìn)行清洗，每次5分鐘，一共4次。

8、將顯色液加入，避光顯色直到有條帶出現(xiàn)放入雙蒸水中使得反應(yīng)終止。