紫外分析儀分為很多系列,有三用紫外分析儀、暗箱式紫外分析儀、可照相紫外分析儀等系列,不同的紫外分析儀有不同的用途。紫外分析儀采用不同波長引進電泳分析、檢測,PCR產(chǎn)物檢測,DNA指紋圖譜分析,紙層分析或薄層分析等。
影響因素
污染
由于引物、各種緩沖液和雙蒸水都會導(dǎo)致污染,因此空白對照應(yīng)在實驗中設(shè)立。
反應(yīng)物
多種成分會對PCR擴增起到制約的作用,產(chǎn)物的指數(shù)式增長只在部分循環(huán)中有所體現(xiàn),逐漸會達到一個平臺期。如果模板和引物濃度足夠理想,那么就會有多態(tài)性豐富、強弱帶分明的RAPD圖譜產(chǎn)生。

引物
引物3端似乎有著更大更加重要的作用。除此以外,如引物二聚體的形成和產(chǎn)物的特異性等反應(yīng)的參數(shù)也受到Mg+2濃度的影響。不同的范圍大約在1.5-4mmol/L內(nèi),不同的結(jié)論由人們在各自的實驗中得出??偠灾?,應(yīng)當事先篩選優(yōu)化各種反應(yīng)物的濃度。
模板
模板濃度
PCR擴增的關(guān)鍵制約因素之一是模板,模板決定了RAPD產(chǎn)物,實驗中十分關(guān)鍵的一個步驟是保證模板的濃度非常精確。如果濃度過高,那么會使得非專一性擴增產(chǎn)物增加;如果濃度過低,那么就不會有較高的分子碰撞機率,存在非常大的偶然性,擴增產(chǎn)物不穩(wěn)定。更加值得注意的是,如果控制不好循環(huán)數(shù),就會過早地將引物消耗光,在后續(xù)的循環(huán)中會導(dǎo)致不等長度的延伸。所以如果原模板有過高的濃度,背景就足以能夠由非專一性擴增產(chǎn)物形成,高濃度模板導(dǎo)致彌散型產(chǎn)物就是這個緣故。
模板純度
相對來說,影響較小的是模板純度,也就是反應(yīng)液中蛋白質(zhì)、多糖、RNA等大分子物質(zhì)有著比較小的影響。
溫度
92-95攝氏度為變性的溫度范圍,94攝氏度為變性常用的溫度,30-60秒為變性的時間范圍;72攝氏度為延伸的溫度,60-120秒為變性的時間范圍;35-37攝氏度為退火的溫度范圍,30-60退火的時間范圍。較高的退火溫度,會增加引物和模板結(jié)合的特異性,退火溫度偏低,引物和模板結(jié)合特異性就會較差,會增加出現(xiàn)的條帶數(shù)量。
在設(shè)計程序和結(jié)果分析時對各種儀器會有不同的控溫、升降溫性能要事先考慮。因此,非常有必要對所用儀器的生產(chǎn)廠家、品牌、規(guī)格進行注明,同一批實驗將反應(yīng)控制在同樣的溫度條件下,得出的結(jié)果才有比較的必要。
溫度的梯度率非常重要,尤為重要的是退火與延伸之間的梯度。
有人表示,采用33-34攝氏度作為退火的溫度在目的為尋找基因差異的實驗中會獲得更加好的效果。在優(yōu)化方案中,可能會提高退火溫度,從而使得背景降低,使得少而清晰的"帶"獲得。
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