手工測(cè)序以及自動(dòng)測(cè)序均屬于DNA序列測(cè)定，手工測(cè)序可分為maxam-gilbert化學(xué)降解法與sanger雙脫氧鏈終止法，事實(shí)上，目前dna序列分析的主流是自動(dòng)測(cè)序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號(hào)DNA測(cè)序儀均已經(jīng)被美國(guó)pe abi公司生產(chǎn)出來(lái)了，在這幾款DNA測(cè)序儀中，臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室使用Z多的一種型號(hào)要屬310型。

發(fā)展歷史

70年代末，化學(xué)法和雙脫氧手動(dòng)測(cè)序，同位素標(biāo)記法分別由WalterGilbert與FrederickSanger發(fā)明出來(lái)。

80年代中期，應(yīng)用雙脫氧終止法原理，自動(dòng)測(cè)序儀出現(xiàn)了，同位素被熒光取代了，計(jì)算機(jī)圖象識(shí)別。

90年代中期，測(cè)序儀得到了重大改進(jìn)，凝膠電泳由集束化的毛細(xì)管電泳取代了。

2001年，人類基因組框架圖被完成。

注意事項(xiàng)

1．bigdye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測(cè)序試劑盒為本實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)序試劑盒，通常650bp左右為可測(cè)dna長(zhǎng)度，(98.5±0.5) %為本儀器dna測(cè)序精確度，如果儀器所需測(cè)定的長(zhǎng)度高于650bp，不能辨讀的堿基n<2%，那么就需要設(shè)計(jì)另外的引物。能夠設(shè)計(jì)反向引物對(duì)同一模板進(jìn)行測(cè)序，相互印證以便確保更為準(zhǔn)確地測(cè)序。能夠人工核對(duì)n堿基，有時(shí)能夠?qū)⑵浔孀x出來(lái)，為了使測(cè)序的精確度提高，按照星號(hào)提示位置，能夠?qū)υ撎幉噬珗D譜進(jìn)行人工分析，進(jìn)一步核對(duì)該處堿基。

2.對(duì)于測(cè)序用戶，僅僅需要將好的dna樣品和引物提供，一個(gè)測(cè)序pcr反應(yīng)使用不一樣的模板，也就需要不同的dna量，pcr測(cè)序只需要比較少的模板的量，通常雙鏈dna需200～500ng，單鏈dna需50～100ng，pcr產(chǎn)物需30～90ng，dna的溶解Z好不要使用te緩沖液，而是使用去離子水或三蒸水。使用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl的引物比較好

3、abi prism 310基因分析儀為精密儀器，必須由專人負(fù)責(zé)操作、管理和維護(hù)。

4、5μl為實(shí)驗(yàn)測(cè)序pcr反應(yīng)的總體積，并且沒有添加礦物油進(jìn)行覆蓋，因此，pcr管蓋的密封性尤為重要，不僅需要在完成試劑添加后將pcr管蓋蓋緊，而且Z好選用pe公司的pcr管。如果在結(jié)束pcr以后，pcr液體積低于4～4.5μl，那么表明該pcr反應(yīng)可能失敗，純化和上樣也就沒有必要。

現(xiàn)狀和意義

在DNA測(cè)序商業(yè)化的浪潮下，完成5個(gè)以上有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因或蛋白的轉(zhuǎn)化應(yīng)用、約500個(gè)新的功能基因的發(fā)現(xiàn)，10000種微生物、100種動(dòng)植物基因組測(cè)序等目標(biāo)在我國(guó)《生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》中被提出。根據(jù)30-50萬(wàn)元為微生物進(jìn)行“基因組完成圖”測(cè)序的大致費(fèi)用而言，千億元級(jí)別為DNA測(cè)序帶來(lái)的市場(chǎng)容量，其還只是DNA測(cè)序商業(yè)應(yīng)用市場(chǎng)的冰山一角。

DNA測(cè)序方法的飛速發(fā)展除了使人類的全基因組序列為我們所知曉，而且還使得我們充分掌握了小麥、水稻、家蠶以及很多細(xì)菌。此時(shí)，科學(xué)家們的新目標(biāo)也就變成了對(duì)一段序列所代表的生物學(xué)意義的探明。用于編碼基因僅僅只有1.5%存在于核苷酸組成的龐大序列中，除此以外，扮演調(diào)控基因表達(dá)的角色有少許，其中功能未知的“垃圾DNA”占絕大部分，這一發(fā)現(xiàn)是科學(xué)家通過(guò)分析人類基因組序列獲得的。由表面可知，人與人之間有著繽紛復(fù)雜的不同之處，然而，深入到DNA水平上，卻僅僅存在0.1%基因編碼序列上的不同。大多數(shù)時(shí)候，人與人之間在一條序列上的差異只有一個(gè)核苷酸，科學(xué)家將這種現(xiàn)象命名為單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，簡(jiǎn)稱SNPs）。