需要綜合應(yīng)用各種技術(shù)研究離子通道結(jié)構(gòu)和功能,所需的技術(shù)包含化學(xué)技術(shù)、基因重組技術(shù)及一些物理、通道藥物學(xué)、人工膜離子通道重建技術(shù)、純化等生化技術(shù)、通道蛋白分離、單通道電流記錄技術(shù)和電壓與電流鉗位技術(shù)。
通蛋離、通建和基重術(shù)
為了能夠測定各亞單位多肽的分子量,需要使用與通道特異結(jié)合的毒劑標(biāo)記,從而從細(xì)胞膜上分離并且純化通道蛋白質(zhì)。然后將分離純化后的通道蛋白質(zhì)加入人工膜,能夠使得通道功能重新恢復(fù)。將含有與該種通道蛋白相關(guān)的mRNA從細(xì)胞中分離出來,然后加入某種細(xì)胞(如大腸桿菌),經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。將cDNA用限制性內(nèi)切酶切割成特定片段,再用核酸雜交方法釣出特定的DNA并克隆。通過對陽性克隆DNA的核苷酸順序進行測定從而對相應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸序列進行結(jié)果的推斷,這就是確定蛋白質(zhì)氨基酸序列的基因重組技術(shù)的程序。

通道藥物學(xué)研究
為了研究通道藥物對通道各種功能的影響,需要應(yīng)用電壓鉗位或單通道電流記錄技術(shù),通過在不同的時間,不同的地方(膜內(nèi)側(cè)或外側(cè)),分別施用各種濃度的藥物。和對藥物分子結(jié)構(gòu)的了解相結(jié)合。不僅能夠?qū)λ幬锖投舅貙θ撕蛣游锷砉δ茏饔玫臋C制進行深入地了解,而且還能夠得到分子水平上通道功能亞單位的類型和構(gòu)象等信息。
單通道電流記錄技術(shù)
又被叫做膜片鉗位技術(shù),在細(xì)胞表面用特制的玻璃微吸管吸附,讓其形成10~100GΩ的密封(giga-seal),被孤立的小膜片面積是μm2量級,這里面只有很少的離子通道,然后對膜片實行電壓鉗位,能夠?qū)?/span>單個離子通道開放產(chǎn)生的pA(10-12安培)量級的電流進行測量。由對單個通道開放和關(guān)閉的電流變化進行觀測,就能夠可直接得到各種離子通道開放壽命分布、開放幾率、開放的電流幅值分布等功能參量,并能夠?qū)λ鼈兣c膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系進行分析。還能夠從細(xì)胞膜上分離出吸管吸附的膜片通過膜的外側(cè)向外或膜的內(nèi)側(cè)向外等方式進行實驗研究。這種技術(shù)便于藥物的施加,膜內(nèi)外溶液成分的改變以及小細(xì)胞的電壓鉗位。
電壓鉗位技術(shù)
通常來說,膜對某種離子通透性的變化是膜電位和時間的函數(shù)。為了測定該膜電位條件下離子電流隨時間變化的動態(tài)過程需要經(jīng)過玻璃微電極與細(xì)胞膜之間形成緊密封接,利用電子學(xué)技術(shù)施加一跨膜電壓并把膜電位固定于某一數(shù)值。可以通過對細(xì)胞內(nèi)外的溶液成分的改變或者藥物施加,從而導(dǎo)致他離子通道失效,就能夠使得被研究的某種離子通道的功能性參量被測定。通過對離子電流的穩(wěn)態(tài)和動力學(xué)與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系進行分析,可以對該種通道的電導(dǎo)、活化和失活速率、離子選擇性等進行推斷,并且可以對通道的門控電流的特性進行測量和分析。
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