分子雜交（molecular hybridization）是指使單鏈核酸堿基序列確定的技術(shù)。待測(cè)單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過(guò)堿基配對(duì)使可檢出的雙螺旋片段形成為分子雜交的基本原理。下面就讓小編帶你了解一下雙鏈DNA探針標(biāo)記法中的隨機(jī)引物合成法。

概念

將DNA模板和寡核苷酸引物結(jié)合經(jīng)過(guò)Klenow酶的作用使得DNA探針合成，合成的DNA探針即為隨機(jī)引物合成雙鏈探針。反應(yīng)中酶的量、dNTP、模板、引物對(duì)合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性均會(huì)產(chǎn)生影響。產(chǎn)物的平均長(zhǎng)度一般是400-600個(gè)核苷酸。

操作準(zhǔn)備：

設(shè)備：恒溫水浴鍋、高速臺(tái)式離心機(jī)等。

材料：待標(biāo)記的DNA片段。

試劑：緩沖液A；[α-32 P] dATP；20mmol/L DTT；Klenow片段；10×隨機(jī)標(biāo)記緩沖液；隨機(jī)引物。

具體操作：

混合1μl 7.5ng隨機(jī)引物以及1μl 200ng雙鏈DNA，然后將混合液放入eppendorf管中，先進(jìn)行5min水浴煮沸，再立刻進(jìn)行1min冰浴。將1μl ddH2O，3μl[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl)，1μl 10×隨機(jī)標(biāo)記緩沖液，1μl 未標(biāo)記的dNTP溶液以及1μl 20mmol/L DTT在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內(nèi)混合。在后管中移入前管中的溶液。將5單位Klenow片段加入到管中，充分混合,使用微型離心機(jī)通過(guò)12000g離心1-2秒, 從而使得所有溶液在試管底部沉著，室溫環(huán)境中保溫3-16h。將10μl緩沖液A加入到反應(yīng)液中，在-20℃下保持放射性標(biāo)記的探針以備使用，與此同時(shí)將放射比活性計(jì)算出來(lái)。

注意事項(xiàng)

1.模板DNA應(yīng)當(dāng)為線(xiàn)性的。

2.需要認(rèn)真調(diào)整引物與模板的比例，如果引物比模板高，那么會(huì)得到較短片段的探針，然而累積較多的產(chǎn)物；相反，則反應(yīng)產(chǎn)物比較長(zhǎng)。

優(yōu)點(diǎn)：

使用隨機(jī)引物反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)如下：

1.在低熔點(diǎn)瓊脂糖中，隨機(jī)引物也能夠直接進(jìn)行反應(yīng)。

2.反應(yīng)產(chǎn)物具有比較到的比活性，比活性能夠達(dá)到4×109 cpm/μg探針。

3.即使使用的質(zhì)粒DNA模板微量也能夠進(jìn)行反應(yīng)，其在反應(yīng)時(shí)對(duì)模板沒(méi)有較為嚴(yán)格的要求。

4.5'→3'外切酶活性不為Klenow片段所具備，能夠穩(wěn)定地進(jìn)行反應(yīng)，從而使大量的有效探針得以獲得。