分子雜交（molecular hybridization）是指使單鏈核酸堿基序列確定的技術(shù)。待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過堿基配對(duì)使可檢出的雙螺旋片段形成為分子雜交的基本原理。下面就讓小編帶你了解一下雙鏈DNA探針標(biāo)記法中的切口平移法。

概念

當(dāng)有切口在雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生時(shí)，在切口的3'羥基末端能夠通過E.coli DNA聚合酶Ⅰ連接核苷酸。與此同時(shí)，從5'→3'的核酸外切酶活性為該酶所具有，可以從切口的5'端將核苷酸去除。因?yàn)橐贿厡⒑塑账崆腥?，一邊又在切口?'端將核苷酸補(bǔ)上，使得切口沿著DNA鏈移動(dòng)，之前沒有放射性的核苷酸可以使用放射性核苷酸代替，在合成新鏈中摻入放射性同位素。50-500個(gè)核苷酸通常為Z適合的切口平移片段。

操作準(zhǔn)備

設(shè)備：恒溫水浴鍋、高速臺(tái)式離心機(jī)等。

材料：10pmol/μl 待標(biāo)記的寡核苷酸

試劑：10mol/L NH4Ac；1mg/ml DNA酶Ⅰ；pH8.0，200mmol/L EDTA；4單位/μl E.coli DNA聚合酶Ⅰ；10μCi/μl [α-32 P]dATP或者400 Ci/mmol [α-32 P] dCTP；未標(biāo)記的dNTP原液；10×切口平移緩沖液

具體操作

將1μlDAN酶 I ，4單位E.coli DNA聚合酶，7μl[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) ，1μg待標(biāo)記的DNA，5μl10×切口平移緩沖液以及10μl的未標(biāo)記的dNTP加水混合成50μl的溶液。將其放入15℃水中水浴60min，將5μl EDTA加入使反應(yīng)終止。將醋酸銨加入到反應(yīng)液中，使得溶液的Z終濃度為0.5mol/L, 將兩倍體積預(yù)冷無水乙醇加入使DNA探針沉淀從而回收。

影響因素

以下幾種因素可能對(duì)切口平移反應(yīng)產(chǎn)生影響：

1.DNA模板中的YZ物

酶的活性會(huì)受到DNA模板中的YZ物的影響，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)當(dāng)使用經(jīng)過認(rèn)真純化之后的DNA。

2.E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量和DNA酶Ⅰ的用量

產(chǎn)物片段的大小會(huì)受到E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量和DNA酶Ⅰ的用量的影響。

3.模板中核苷酸被置換的程度和[α-32 P]dNTP的比活性

模板中核苷酸被置換的程度和[α-32 P]dNTP的比活性對(duì)產(chǎn)物的比活性起到?jīng)Q定作用。

注意事項(xiàng)

1.所得到的探針比活性取決于DNA酶Ⅰ的活性，如果DNA酶Ⅰ具有較高的活性，那么所得探針就具有較高的比活性，然而其卻具有較短的長度。

2.探針標(biāo)記一般使用[α-32 P]-dNTP，雖然3H，32P及35S標(biāo)記的dNTP也都能夠使用。