研究背景

宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）是生物制品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的關(guān)鍵工藝相關(guān)雜質(zhì)之一，除了我們熟知的可導(dǎo)致患者不良的免疫反應(yīng)、超敏反應(yīng)、引起蛋白降解等影響產(chǎn)品的安全性和有效性問題之外，近年來(lái)Z 新的研究表明，HCPs 中的部分酯酶和脂肪酶參與了抗體藥物制劑中吐溫（聚山梨酯，polysorbate）的水解【1】。其中的一些脂肪酶和酯酶能夠水解吐溫結(jié)構(gòu)中的酯鍵部位，生成游離脂肪酸和聚山梨醇，見下圖 1。

圖 1. 聚山梨酯 20（PS20）水解示意圖

吐溫是高度異質(zhì)的混合物，容易通過多種途徑發(fā)生降解，如化學(xué)水解、氧化水解和酶水解等。抗體制劑中吐溫的降解不僅降低了表面活性劑的真實(shí)濃度，而且還與不溶性微粒的形成有關(guān){2}。酶水解在目前被認(rèn)為是在抗體藥物中吐溫降解的主要原因之一，如圖 2。

圖 2. 吐溫水解通路示意圖

由于酶催化吐溫的水解反應(yīng)在酶含量低至 ppm 水平時(shí)依然發(fā)生，因此建立 HCPs 酯酶/脂肪酶痕量水平的目標(biāo)蛋白定量分析方法顯得尤為重要。當(dāng)前 HCPs 的分析方法當(dāng)中，酶聯(lián)免疫法（ELISA法）靈敏度高，能夠檢測(cè)到痕量 HCPs 殘留，但是現(xiàn)有分析方法更加側(cè)重 HCPs 總量的分析，缺乏針對(duì)導(dǎo)致吐溫降解的 HCPs 酯酶/脂肪酶的目標(biāo)蛋白分析方法，因此通用 HCP 試劑盒的 ELISA 方法檢測(cè)到的 HCP 含量與吐溫降解沒有直接關(guān)聯(lián)性。液相色譜高分辨質(zhì)譜法（LC-HRMS）能夠檢測(cè)到不同種類的 HCPs，但是檢測(cè)靈敏度不足，對(duì)于 ppm 水平含量的酯酶/脂肪酶無(wú)能為力。Agilent 創(chuàng)新應(yīng)用中心使用 Agilent Infinity II 1290 接 6495C 三重四極桿質(zhì)譜開發(fā)了 HCPs 定量方法。對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道的導(dǎo)致吐溫水解的5中酯酶/脂肪酶 {1}[3]，檢測(cè)定量限低至 0.5 ppm，方法靈敏度高，特征性好，是目前Z 佳分析手段之一。所開發(fā)的方法可用于不同應(yīng)用場(chǎng)景下的 HCPs 酯酶/脂肪酶檢測(cè)，如細(xì)胞株篩選階段、純化工藝過程監(jiān)控，或者放行檢測(cè)等。

基于吐溫降解以及可見異物/不溶性微粒形成對(duì)抗體制劑穩(wěn)定性的重大影響，在 HCPs 定量方法之外，Agilent 也在跟行業(yè)用戶的合作當(dāng)中，對(duì)吐溫降解導(dǎo)致不溶性微粒的研究提供全面的分析儀器技術(shù)支持，包括吐溫定量、吐溫精細(xì)表征、游離脂肪酸含量分析（見以下往期微信推送鏈接），助力抗體藥物行業(yè)健康發(fā)展。

實(shí)驗(yàn)方案

儀器和設(shè)備

1290 infinity II Bio 生物大分子專用超高效液相色譜系統(tǒng)，配置如下

• 二元泵（G7132A）

• 自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào) G7137A），配多通道進(jìn)樣清洗系統(tǒng)

• 柱溫箱（部件號(hào) G7116B）

色譜柱

Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C18，2.1 x100，1.8um

質(zhì)譜系統(tǒng)

Agilent 6495C 三重四極桿質(zhì)譜

方法開發(fā)與驗(yàn)證

樣品處理 [4]

1、酶解，取 1mg mAb 藥物，加入 10ul 1M 碳酸氫銨溶液，5uL 0.5mg/ml 的胰蛋白酶（Trypsin），用超純水補(bǔ)足至 200uL，37℃ 孵育 4 小時(shí)；

2、蛋白沉淀：樣品取出恢復(fù)到室溫，加入 2uL 50 mg/ml DTT 溶液，90 ℃ 下加熱 10min，取出后 13000 轉(zhuǎn)離心 2min，取上清液上機(jī)。

方法驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)對(duì)照品來(lái)自 5 種 HCPs 酶的 8 個(gè)合成特征肽段。進(jìn)行了基于 NIST mAb 的基質(zhì)添加回收率測(cè)試，定量限測(cè)試，線性測(cè)試實(shí)驗(yàn)。Z 后使用開發(fā)的方法檢測(cè)了實(shí)際樣品——這些樣品分別來(lái)自實(shí)際發(fā)現(xiàn)不溶性微粒的過期樣品和工藝過程樣品。

相關(guān)分析結(jié)果見后續(xù)譜圖。

圖 3. 特征肽段 LLOQ 水平（0.05ng/ml）基質(zhì)添加色譜圖

圖 4. 特征肽段標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖 5. 特征肽段 NIST mAb 添加回收測(cè)試

結(jié) 語(yǔ)

抗體藥物制劑中吐溫會(huì)發(fā)生降解，進(jìn)而產(chǎn)生不溶性微粒的風(fēng)險(xiǎn)，其中 HCP 酯酶水解是吐溫的主要降解途徑之一

吐溫降解與可見異物/不溶性微粒形成機(jī)制研究過程中，需要全面使用 LC/ELSD 和 Bio LC SEC/VWD/MALs 分析技術(shù)平臺(tái)，LC/MS&LC-MS/MS 分析技術(shù)平臺(tái)，LC-QTOF 分析技術(shù)平臺(tái)

Agilent 在跟行業(yè)用戶的合作當(dāng)中，對(duì)吐溫降解導(dǎo)致不溶性微粒的研究提供全面的分析儀器技術(shù)支持，助力抗體藥物行業(yè)健康發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]. NR. Larson, Yangjie Wei, et al. Comparison of Polysorbate 80 Hydrolysis and Oxidation on the Aggregation of a Monoclonal Antibody [J]. J Pharm Sci. 2020 Jan;109(1):633-639

[2]. 賈東晨，何伍?？贵w藥物制劑處 方中的可見異物/ 不溶性微粒，《中國(guó)新藥雜志》2022 年第31 卷第10 期

[3]. X Gao, B Rawal, Y Wang, et al. Targeted Host Cell Protein Quantification by LC?MRM Enables Biologics Processing and Product Characterization[J]. Anal.Chem. 2020,92,1007?1015

[4]. L Huang, Ning Wang, CE Mitchell, et al. Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies [J]. Anal. Chem. 2017, 89, 10, 5436–5444