目前實(shí)體瘤細(xì)胞治 療的主要障礙是效應(yīng)細(xì)胞難以進(jìn)入到腫瘤組織中，克服這一挑戰(zhàn)的主要策略就是增加效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織的趨化特性。2021年Lesch等人在Nature Biomedical Engineering上提出了一種anti-MSLN CAR-T 細(xì)胞，其細(xì)胞表面同時(shí)高表達(dá)C-X-C趨化因子受體6（CXCR6），能夠增強(qiáng)T細(xì)胞對胰 腺癌細(xì)胞的識別和裂解，從而增強(qiáng)治  療 效果。因此，需要一個(gè)系統(tǒng)的方法對這種存在趨化能力的CAR-T細(xì)胞的遷移和細(xì)胞毒性能力進(jìn)行評估。

近日，科學(xué)家在STAR Protocols發(fā)表了一種實(shí)驗(yàn)方案：“Transwell migration assay to interrogate human CAR-T cell chemotaxis”，該方案詳細(xì)描述了T細(xì)胞的分離和激活，轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增，遷移實(shí)驗(yàn)以及殺傷實(shí)驗(yàn)。其中在遷移殺傷實(shí)驗(yàn)中結(jié)合了Transwell與基于阻抗的xCELLigence real-time cell analyzer (RTCA)系統(tǒng)，為CAR-T的趨化潛力篩選提供了一個(gè)可靠的方案。

圖1. 完整實(shí)驗(yàn)流程圖

聯(lián)合實(shí)驗(yàn)步驟

1. 接種靶細(xì)胞 到E-plate

1.1 將培養(yǎng)基等其他試劑預(yù)熱到37℃，取出E-plate 96孔板并加入50μL殺傷培養(yǎng)基，將E-palte放入RTCA cradle上進(jìn)行基線掃描（step1）；

1.2 將靶細(xì)胞（MSLN-CXCL16-過表達(dá)SUIT-2細(xì)胞（SUIT-2-MSLN-CXCL16細(xì)胞））接種到E-plate中，100μL/孔，根據(jù)不同細(xì)胞類型可接種5,000-10,0000個(gè)細(xì)胞每孔，接種后將細(xì)胞置于室溫平衡靜置45-60min使細(xì)胞完全沉降；

1.3 靜置后將E-plate置于RTCA cradle，啟動RTCA實(shí)驗(yàn)的step2進(jìn)行細(xì)胞增殖的實(shí)時(shí)監(jiān)測，直到增殖到合適的Cell Index值（例如1-2）；

2. Transwell 遷移經(jīng)驗(yàn)

2.1 接種2.5 x 104 SUIT-2-MSLN-CXCL16細(xì)胞/孔到TC處理的Transwell下室，終體積在225μL的培養(yǎng)基中，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

2.2 24h后，收集效應(yīng)細(xì)胞（anti-MSLN-CAR-T and anti-MSLN-CAR-CXCR6-T細(xì)胞），并將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到5 x 105 cells/70μL；

2.3 取出Transwell板，將上室放入板中，并將70μL效應(yīng)細(xì)胞加到上室中，輕輕地蓋上蓋子，不要施加任何壓力，然后將板轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。讓細(xì)胞遷移4小時(shí)。

3. 接種效應(yīng)細(xì)胞到E-plate

3.1 確保E-plate中的靶細(xì)胞增殖到合適的Cell Index值，然后將遷移結(jié)束的Transwell板子輕輕取出，用棉簽將上室中的液體完全去除，確保沒有破壞Transwell膜，并輕輕取下上室；

3.2 暫停RTCA運(yùn)行步驟（step2），并進(jìn)入下一步驟（step3），當(dāng)step3第 一次掃描結(jié)束后立即暫停實(shí)驗(yàn)，并輕輕取下E-plate；

3.3 將Transwell下室中遷移的CAR-T細(xì)胞輕輕混勻，從其中取出100μL遷移的CAR-T細(xì)胞加入到E-plate中進(jìn)行靶細(xì)胞的殺傷，蓋上蓋子后將E-plate繼續(xù)放入RTCA儀器中并繼續(xù)數(shù)據(jù)的采集。

圖2. 遷移與細(xì)胞殺傷聯(lián)合試驗(yàn)圖示

結(jié)果與討論

遷移實(shí)驗(yàn)中，將遷移到下室的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以anti-MSLN-CAR-T細(xì)胞為基準(zhǔn)1，得出趨化指數(shù)，CXCR6武裝的anti-MSLN-CAR-T細(xì)胞趨化指數(shù)1.5左右，結(jié)果表明CXCR6明顯增強(qiáng)了CAR-T的趨化能力（圖3.A）。同時(shí)檢測遷移到下室的CAR-T細(xì)胞的CAR陽性比例，與遷移前的陽性比例對比（藍(lán)色），CXCR6武裝的anti-MSLN-CAR-T細(xì)胞遷移到下室的CAR陽性細(xì)胞比例更高（橘色），而對照組anti-MSLN-CAR-T細(xì)胞遷移到下室的CAR陽性細(xì)胞比例降低（圖3.B）。

遷移后殺傷實(shí)驗(yàn)在實(shí)時(shí)無標(biāo)記的RTCA上進(jìn)行，其中遷移的CXCR6武裝的anti-MSLN-CAR-T細(xì)胞組的cell indexZ 低且保持持續(xù)下降（圖3.C），表明其殺傷能力Z 強(qiáng)，CXCR6增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的趨化能力并發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤活性。因此用腫瘤特異性趨化因子受體武裝腫瘤特異性T細(xì)胞是有希望實(shí)現(xiàn)實(shí)體瘤過繼細(xì)胞治 療的策略。

圖3. 細(xì)胞遷移與細(xì)胞殺傷結(jié)果

綜上所述

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)合依賴阻抗的實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析（RTCA）進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量以及健康狀態(tài)的監(jiān)測實(shí)驗(yàn)。使用這種方法，研究人員可以通過檢測CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性能力以及它們的遷移潛力，為CAR-T趨化能力分析引入一個(gè)新的維度。