白酒風(fēng)味、品質(zhì)研究正成為行業(yè)熱點(diǎn)。影響白酒品質(zhì)的因素有多種，其中發(fā)酵是關(guān)鍵因素。大曲作為白酒釀造過程的發(fā)酵劑，不僅為白酒釀造提供微生物，還提供風(fēng)味物質(zhì)及其前體，因此，大曲的品質(zhì)與白酒品質(zhì)密切相關(guān)。羰基化合物是大曲的風(fēng)味物質(zhì)之一，其對大曲的品質(zhì)影響很大。高覆蓋分析大曲中的羰基化合物，不僅有助于評價大曲的品質(zhì)，而且可以指導(dǎo)高品質(zhì)白酒生產(chǎn)。但羰基化合物具有結(jié)構(gòu)多樣、質(zhì)譜信號響應(yīng)低等特點(diǎn)，需要高靈敏、高分辨質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)高覆蓋檢測。

為了滿足行業(yè)前沿需求，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所許國旺研究團(tuán)隊與茅臺集團(tuán)微生物研究團(tuán)隊合作，在 Journal of Chromatography A 發(fā)表題為“Profiling and annotation of carbonyl compounds in Baijiu Daqu by chlorine isotope labeling-assisted ultrahigh-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry”的研究論文，提出了一種基于氯同位素標(biāo)記輔助結(jié)合超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q/TOF MS）高覆蓋篩選和深度注釋白酒大曲中羰基化合物的策略。采用該策略，在醬香型白酒大曲中檢測和注釋了 487 種羰基化合物，其中 341 個得到準(zhǔn)確鑒定或推測鑒定。這是迄今為止大曲中羰基化合物數(shù)目Z 多的報道。在準(zhǔn)確鑒定的化合物中，有 5 種從未在白酒和大曲中報導(dǎo)過。

該研究建立的方法具有高效、經(jīng)濟(jì)、簡便等優(yōu)點(diǎn)，為復(fù)雜生物樣品中羰基化合物的全景分析提供了一種新策略。

羰基化合物的整體注釋策略

白酒大曲中羰基化合物的注釋策略流程如下（圖 1）：

• 首先，利用 Agilent 6546 Q-TOF 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，對 2-肼基-4-氯吡啶（HP-Cl）標(biāo)記后的樣品全掃描分析，依據(jù) Cl 元素的天然同位素特征及保留時間的一致性，提取出潛在羰基化合物。

• 其次，對潛在羰基化合物進(jìn)行靶向 MS/MS 分析。

• Z 后基于化合物的 tR、MS1、MS/MS 和特征碎片，將提取出來的潛在羰基化合物注釋為 6 個等級，用于對鑒定結(jié)果的綜合判斷。

圖 1. 醬香型白酒大曲中羰基化合物的注釋策略

本策略無需重同位素標(biāo)記試劑，利用氯的天然同位素特征來篩選衍生化的羰基化合物，同時結(jié)合 MS1、預(yù)測保留時間（tR）、in silico MS/MS 和人工注釋碎片等多維信息，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣本中羰基化合物的深度注釋。

醬香白酒大曲中羰基化合物的高覆蓋鑒定

采用上述方法，對醬香型白酒大曲中的羰基化合物進(jìn)行了全面表征和鑒定。以 5- 羥甲基糠醛為例具體示意整個鑒定流程（圖 2）。

圖 2. 醬香型大曲中 5-羥甲基糠醛的鑒定過程：（A）大曲中 5-羥甲基糠醛的MS1同位素峰，（B）大曲中 5-羥甲基糠醛的 MS/MS（C）三個候選結(jié)構(gòu)的tR，（D）tR = 4.58 min and m/z = 252.0539 待測峰的結(jié)構(gòu)注釋，（E）大曲和標(biāo)樣的 5-羥甲基糠醛 EIC 對比圖，（F）大曲和標(biāo)樣的 5- 羥甲基糠醛 MS/MS 對比圖

本研究在醬香型白酒大曲中共檢出 487 種羰基化合物，其中 341 個得到準(zhǔn)確鑒定或推測鑒定，對比已有文獻(xiàn)，這是迄今為止大曲中羰基化合物數(shù)目Z 多的報道。此外，在準(zhǔn)確鑒定的化合物中，有 5 種羰基化合物從未在在白酒和大曲中報導(dǎo)過。

不同生態(tài)位和不同季節(jié)大曲的差異分析

文章進(jìn)一步結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析，采用主成分分析（PCA）、火山圖等，對不同生態(tài)位（黃、白、黑曲）和不同季節(jié)（春、夏、秋）生產(chǎn)的大曲羰基化合物進(jìn)行了差異研究，發(fā)現(xiàn)：白、黃、黑曲中羰基化合物存在顯著性差異（圖 3）；夏、春、秋季大曲中的羰基化合物差異也很大（圖 4）。這可能與制曲初期，黑色大曲的溫度Z 高，白色大曲的溫度Z 低，加上夏季溫度高于春季溫度和秋季溫度，導(dǎo)致發(fā)酵溫度影響羰基化合物在大曲中的分布，且發(fā)酵溫度越高，產(chǎn)生的羰基化合物就越多的緣故。

圖 3. 比較不同顏色夏季大曲中的羰基化合物：（A）PCA 得分圖，（B）黑色大曲 vs 白色大曲的火山圖，（C）黃色大曲 vs 白色大曲的火山圖

圖 4. 春、夏、秋黑大曲中羰基化合物的二維主成分分析得分圖（A）、夏季大曲與春季大曲中羰基化合物的火山圖（B）、夏季大曲與秋季大曲中羰基化合物的火山圖（C）

為了研究造成不同大曲之間羰基化合物顯著差異的原因，本研究還將羰基化合物與大曲的酸度、糖化能力、還原糖含量、水分和淀粉含量等理化參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析（圖 5）。夏季不同顏色大曲中的羰基化合物主要與大曲的酸度呈正相關(guān)，而與糖化力呈負(fù)相關(guān)。不同季節(jié)黑色大曲中的羰基化合物主要與大曲的酸度、還原糖含量和水分相關(guān)。且大曲的酸度、還原糖含量與大曲中的羰基化合物呈正相關(guān)，而大曲的水分與大曲中的羰基化合物呈負(fù)相關(guān)?？梢姡?b>大曲的糖化力、酸度、還原糖含量和水分對大曲中的羰基化合物有很大的影響。因此，在大曲的制作過程中，調(diào)整這些參數(shù)將會影響大曲中的羰基化合物的產(chǎn)生，進(jìn)而影響大曲的品質(zhì)和白酒品質(zhì)。

圖 5. 理化指標(biāo)與不同顏色大曲中羰基化合物變化的相關(guān)性研究（A）、大曲不同季節(jié)理化指標(biāo)與羰基化合物變化的相關(guān)性研究（B）

本研究開發(fā)了一種基于氯同位素標(biāo)記、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（CIL-UHPLC-Q/TOF MS）技術(shù)，對白酒大曲中羰基化合物進(jìn)行高覆蓋率、高靈敏分析的策略，結(jié)合數(shù)據(jù)挖掘算法和統(tǒng)計分析，為揭示不同種類大曲羰基化合物代謝特征提供技術(shù)支撐，對大曲質(zhì)量評估和白酒風(fēng)味、品質(zhì)研究具有重要意義。

專家介紹

許國旺

中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所研究員

中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部常務(wù)副主任，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重 點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，代謝組學(xué)研究中心主任。2004 年獲國家自然科學(xué)基金委杰出青年基金資助?，F(xiàn)任中國化學(xué)會色譜專業(yè)委員會主任、中國抗 癌協(xié)會腫瘤代謝委員會副主任、中國生物工程學(xué)會系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會副主任、中國化學(xué)會理事等。

正在擔(dān)任 TrAC-Trends Anal Chem 的特約編輯, Metabolites 的副主編及 Anal Chem（2021-2022）, Anal Chim Acta，J Proteome Res 等 10 多個雜志編委。國際 HPLC 會議科學(xué)委員會常委。

已在 PNAS, Nat Protoc, Nat Commun, Hepatology, Adv Sci, Diabetes Care, Cancer Res, Clin Chem, Anal Chem 等國際著名雜志發(fā)表多篇高水平文章。連續(xù) 4 次入選“全 球 100 名Z 有影響分析科學(xué)家”，連續(xù) 7 年入選愛思唯爾“中國高被引學(xué)者”榜單。申請發(fā)明專利超百件（其中 90 多項已授權(quán)）。

課題組主要研究方向：復(fù)雜樣品分離分析方法的創(chuàng)新性研究；代謝組學(xué)、暴露組學(xué)分析技術(shù)平臺及其在疾病、中藥、植物表型、食品安全等方面的應(yīng)用研究。

參考文獻(xiàn)：

https://doi.org/10.1016/j.chroma.2023.464110