提 要 本文介紹一種新型氨基酸分析方法離子交換色譜-積分脈沖安培法(HPIC-IPAD)，詳細(xì)討論方法的原理和應(yīng)用，該方法與傳統(tǒng)方法比較，無須進(jìn)行柱后或柱前衍生反應(yīng)，對氨基酸可以直接進(jìn)行分析，靈敏度高，大多數(shù)氨基酸的Z小檢測限均小于1pmol，線性范圍可以達(dá)到3個數(shù)量級以上 關(guān)鍵詞：氨基酸，離子交換色譜-積分脈沖安培法 1 前言 較為經(jīng)典的氨基酸分析方法是陽離子交換分離, 柱后衍生反應(yīng)，紫外分光或熒光檢測[1]常用的衍生試劑有茚三酮（Ninhydrin）和鄰苯二甲醛（OPA）此外還有柱前衍生-反相分離，衍生試劑有AQC(6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl-carbamate)，F(xiàn)MOC(9-fluorenylmethylchloroformate)，Dabsyl(4-di-methylamino-azobenzene sulfonylchloride)，Dansyl等這些方法的缺點是操作復(fù)雜和影響因素多，如柱后衍生需要柱后衍生反應(yīng)的附加裝置和衍生試劑；柱前衍生雖然克服了柱后衍生的一些缺點，但存在氨基酸衍生物的不穩(wěn)定，衍生反應(yīng)的副產(chǎn)物和試劑本身干擾等缺點[2]本文將討論的美國Dionex公司新近推出的氨基酸直接分析方法是基于陰離子交換分離，積分脈沖安培法檢測，無需將待測氨基酸轉(zhuǎn)變成可被檢測的化合物的衍生反應(yīng) 2 方法原理 2.1 陰離子交換分離 迄今為止，自然界中已發(fā)現(xiàn)180多種氨基酸，其中參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸只有20多種，稱為基本氨基酸這些氨基酸的基本結(jié)構(gòu)通式如下： H RCCOO - NH3+ 氨基酸具有兩性離子結(jié)構(gòu)，在酸性介質(zhì)中，以氨基陽離子狀態(tài)存在；在堿性介質(zhì)中，以羧基陰離子狀態(tài)存在，這也是氨基酸分離分析方法的基礎(chǔ)氨基酸直接分析用疏水性薄殼型陰離子交換樹脂為固定相，堿性溶液為流動相，陰離子交換分離，積分脈沖安培法直接檢測流動相由水氫氧化鈉和醋酸鈉溶液組成其中氫氧化鈉不僅提供淋洗離子OH-，而且堿性pH條件也是氨基酸在金電極表面進(jìn)行氧化反應(yīng)，實現(xiàn)積分脈沖安培檢測的必須條件醋酸根離子（Ac-）對固定相的親和力大于OH-，它對于極性較小，保留較強(qiáng)的氨基酸起推的作用表1列出了分析氨基酸的典型梯度淋洗條件[3]圖1是常見氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖[3] 2.2脈沖積分安培檢測 在高pH溶液中，含有脂肪氨基（-NH3）的化合物可在金電極上被氧化，因此可用電化學(xué)法檢測，然而由于金電極吸附待測成分的氧化產(chǎn)物以及金電極表面形成氧化層，金電極會很快失效為了解決這一問題，發(fā)展的電化學(xué)檢測醇類和含氨基化合物的脈沖電化學(xué)檢測器，由三個不同的脈沖電位代替直流安培檢測器中的加于工作電極上的恒定電位較工作電位高的正電位用來除去金電極上被測成分的氧化產(chǎn)物由于金電極本身會部分被氧化成氧化金，再加一個大的負(fù)電位，使氧化金還原到還原狀態(tài)該脈沖每0.5~1秒循環(huán)1次Polta等[4]S次報道了氨基酸的脈沖電化學(xué)檢測在金電極上得到氨基的Zda氧化電流所需的電位超過金表面氧化的電位，金電極表面氧化所產(chǎn)生的電流無疑會增加背景和基線噪音以及基線的不穩(wěn)定性為了增加氨基氧化時所產(chǎn)生的檢測信號，YZ金電極氧化所產(chǎn)生的背景信號，1989年Johnson等人[5]引入了一個新的技術(shù)脈沖積分安培與脈沖安培相似，積分安培法中加到工作電極上的也是一種自動重復(fù)的電位對時間的脈沖電位波形，其不同之處是采樣時的電位不是恒定的，而是在高-低值之間掃描在高電位時，氨基和金的氧化同時發(fā)生在高電位時所形成的氧化金在低電位時被還原因為在低電位時金的氧化是可逆的，而氨基的氧化是不可逆的，因而來自金電極氧化的信號被大大抵消，由積分整個高-低循環(huán)的電流所得到的信號僅僅是被分析成分的信號 檢測氨基酸和氨基糖的積分安培波形與早期的波形相似，但首先用負(fù)電位為清洗電位，這樣可較好地保持電極的清潔和活性，不會引起電極和信號的損失在前述的脈沖安培法中，首先用高的電位為清洗電位，金電極的過量氧化會導(dǎo)致檢測響應(yīng)值的逐漸降低經(jīng)過對檢測氨基酸和氨基糖的施加電位波形的優(yōu)化克服了基線漂移，改進(jìn)了線性信噪比和長時間的重復(fù)性，而且不損壞金工作電極（節(jié)選） 該文發(fā)表在現(xiàn)代科學(xué)儀器2001年第二期 AAA-Direct氨基酸直接分析儀