我們在進(jìn)行qPCR實驗時，不僅僅要確定自己的研究方向，確認(rèn)目標(biāo)基因，還要針對內(nèi)參基因做好選擇。內(nèi)參基因的作用就是去除不同樣本在RNA產(chǎn)量、質(zhì)量以及反轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別，從而獲得目的基因特異性表達(dá)的真正差異。這里給小伙伴們舉個例子。

測試一款減少黑色素表達(dá)的藥物，該藥物以灌胃的形式給藥至實驗組小鼠，對照組小鼠僅以正常飲用水進(jìn)行灌胃，以往大量研究已表明該藥物對于黑色素表達(dá)有明顯的抑制作用。

如果研究目的基因，簡單僅以兩組的目的基因表達(dá)量相比，可以發(fā)現(xiàn)，實驗組生成黑色素的基因表達(dá)量相比于對照組要多四倍。

然而已有大量研究證明該藥物抑制黑色素表達(dá)，計算結(jié)果與已有理論存在相悖的情況(也有可能是發(fā)現(xiàn)了新課題o(*￣▽￣*)ブ)。為什么會出現(xiàn)這個結(jié)果呢？其原因可能主要是兩組小鼠RNA提取的時候處于不同的時間、提取樣本量不一樣、cDNA上樣量不一樣、cDNA濃度不一樣等等。內(nèi)參基因?qū)Υ诉M(jìn)行了校正和標(biāo)準(zhǔn)化。

通常情況下，對于內(nèi)參基因的選擇往往會不假思索地選擇GAPDH和β-aCtin或18S rRNA之類的內(nèi)參基因。除了這些，我們似乎沒有別的更好的選擇。即使對這些基因產(chǎn)生了質(zhì)疑，無論是查閱參考文獻(xiàn)還是與師兄師姐討論過后，最后大概率還是確定了之前的選擇。久而久之，GAPDH和β-aCtin或18S rRNA三位在內(nèi)參基因界的江湖地位就已經(jīng)不可動搖了。

這篇文章我們來扒一扒上述三個內(nèi)參基因。

GAPDH是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的縮寫，經(jīng)典的糖酵解反應(yīng)中的一個酶。該酶廣泛存在于眾多生物體中，并且在細(xì)胞中含量豐富，占總蛋白的10%-20%。GAPDH基因有高度保守的序列，在同種細(xì)胞或者組織中的蛋白表達(dá)量一般是恒定的。故長期以來該基因被廣泛用作qPCR或Western blot中的內(nèi)參基因。

GAPDH基因是糖酵解中的關(guān)鍵基因，正是因為如此，在代謝中過程中的表達(dá)很容易受到多種因素的影響。如在細(xì)胞的增殖過程中，細(xì)胞需要的能量ATP增多，糖酵解代謝加大，GAPDH基因的表達(dá)水平很有可能被上調(diào)。有報道稱，該基因可作為腫瘤發(fā)生的標(biāo)志物，在腫瘤組織與正常細(xì)胞及癌旁正常組織比較時，GAPDH表達(dá)并不一致。故在比較腫瘤組織與正常組織或細(xì)胞的某種基因或蛋白的表達(dá)時，GAPDH作為內(nèi)參應(yīng)慎重。

β-actin選作內(nèi)參基因因其序列高度保守，其mRNA表達(dá)數(shù)量高，是橫紋肌肌纖維中的一種主要的蛋白成分，也是肌肉細(xì)絲及細(xì)胞骨架微絲的主要成分。該基因幾乎在所有真核細(xì)胞中表達(dá)，廣泛存在哺乳動物動物的組織與細(xì)胞內(nèi)。故作為內(nèi)參基因是得到公認(rèn)的。

對于actin蛋白由幾種異構(gòu)體組成，actin大致可以分為6種，存在于組織分布特異性，不同actin之間具有較大的序列相似性(>90%)。在肌肉組織中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的組織都適合選β-actin作為內(nèi)參。例如當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時，β-actin mRNA的表達(dá)水平增加；而假基因的的存在也可干擾β-actin的檢測，此時并不適合選擇β-actin作為內(nèi)參。

18S rRNA與30多種核糖體蛋白共同構(gòu)成真核生物核糖體40S小亞基，從而與60S大亞基一起完成細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成。

18S rRNA作為內(nèi)參的原因可總結(jié)如下：

①18S rRNA存在于核糖體小亞基中，其編碼基因rDNA（18S rRNA/rDNA）在生物演化過程中相當(dāng)保守；

②存在于所有真核生物細(xì)胞中； 

③易于使用通用引物擴(kuò)增；

④rRNA的合成是由RNA聚合酶I合成，mRNA是由RNA聚合酶II合成，因此rRNA合成的調(diào)節(jié)獨(dú)立于mRNA，在影響mRNA表達(dá)的各種條件下，各種rRNA水平很少發(fā)生變化；

⑤rRNA屬于高峰度表達(dá)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目標(biāo)mRNA，較其他內(nèi)參基因穩(wěn)定且受RNA降解影響較小。故18S rRNA被廣泛選作內(nèi)參。

同樣是rRNA的5S rRNA和5.8S rRNA以及28S rRNA就不適合作為內(nèi)參，因為①5S與5.8S在核糖體大亞基中的rRNA分子序列短，提供的信息少；②28S rRNA序列雖然較長，可提供更多的信息，能更準(zhǔn)確地揭示系統(tǒng)發(fā)育的規(guī)律，但基因數(shù)據(jù)庫中相關(guān)信息較少，不利于比較分析。

然而，rRNA的轉(zhuǎn)錄易受到各種生物因素和藥物的影響。在有絲分裂期間，28S、18S rRNA明顯減少或停止表達(dá)。此外存在很大爭議的是rRNA沒有poly(A)尾，在以oligo(dT)為引物的cDNA合成中不能被反轉(zhuǎn)錄，建議在反轉(zhuǎn)錄的過程中除用oligo(dT)引物外，還要用18S作為反向引物，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA最好用RNA酶處理一下，再高溫滅活。

其實不僅僅是GAPDH和β-aCtin或18S rRNA這三個基因在作為內(nèi)參基因的存在問題，其他的很多內(nèi)參基因在不同組織中的表達(dá)水平也是存在較大差異的。如不同內(nèi)參基因在不同組織中表達(dá)波動較大的HPRT基因△Ct為10.3；同一內(nèi)參基因在不同的組織中，如心，腦，胎盤，肺，肝，骨骼肌，腎等組織中表達(dá)也不是恒定的。見下圖：

不同的內(nèi)參基因在不同組織中Ct變化

不同內(nèi)參基因在不同組織中表達(dá)差異

沒有一種RNA的表達(dá)水平在所有條件下是恒定的，在各種因素的影響下，如細(xì)胞周期的不同階段，內(nèi)參基因的RNA表達(dá)水平是變化的。至今，不存在任何一種基因適用于所有類型的細(xì)胞或組織。故我們研究者應(yīng)該根據(jù)自己所研究的細(xì)胞和組織類型以及實驗要求，做預(yù)實驗。從多種內(nèi)參基因中篩選出適合自己實驗的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。同時也可以選擇多內(nèi)參基因的研究方法，設(shè)置兩個或兩個以上內(nèi)參基因，取平均值，然后去校正自己的目的基因能夠得到更可靠的結(jié)果。

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