免疫組化（IHC）作為生物和醫(yī)學研究中定位蛋白表達的常用技術，其結果的特異性與準確性將直接決定后續(xù)研究的可靠性與深度。然而，IHC操作步驟繁瑣，我們常常因某一環(huán)節(jié)的疏忽而陷入困境。

封閉（Blocking）常被定義為“簡單輔助步驟”而被草率對待。但是，當您的實驗頻繁遭遇假陽性、假陰性或高背景困擾時，根源可能就藏在這被低估的操作里。對封閉液作用機制的理解不足、使用方法不當，或是忽略了樣本的組織特異性，都有可能影響IHC結果準確性。

「IHC診斷室」第8期，一起來梳理封閉操作的原理及作用機制。

一、封閉技術的誕生

封閉概念來源于免疫組化。早在20世紀30年代，IHC的原理就已為學界所熟知。但直到1942年，第一個IHC研究成果才正式發(fā)表。哈佛大學醫(yī)學院免疫學家Albert H. Coons團隊開創(chuàng)性地利用FITC標記的抗體，成功鑒定了感染組織中的肺炎球菌抗原。

隨著IHC技術的應用范圍擴大，研究人員發(fā)現(xiàn)非特異性結合、背景信號高等問題嚴重影響了染色結果的準確性。通過使用正常兔血清消除抗體的非特異性結合，成功攻克這一難題，為生物化學帶來了全新的概念：封閉液。

隨著免疫學技術的日新月異，封閉已成為IHC、WB、ELISA、流式細胞術等實驗流程中不可或缺的標準環(huán)節(jié)。1984年，David A. Johnson團隊在Western Blot實驗中創(chuàng)新性地采用BLOTT（Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer，即5%脫脂奶粉）替代早期的魚精DNA和Denhardt's試劑作為封閉液。研究證實，該方案在降低非特異性結合方面顯著優(yōu)于明膠，能夠有效抑制背景信號，為后續(xù)實驗優(yōu)化提供了新思路。

二、封閉定位：因何封？何時封？如何封？

理解封閉在整體流程中的定位，是掌握這項技術的第一步。

若封閉操作不當易出現(xiàn)以下兩種情況：

封閉不足，導致高背景

封閉不充分會導致抗體與樣本中的蛋白發(fā)生非特異性結合，導致背景彌漫性，而非特定結構（如細胞核、膠原纖維）選擇性著色。若出現(xiàn)細胞核或膠原纖維等特定結構的染色，還需排查一抗特異性不足、二抗交叉反應、內源性物質干擾等因素。

假陰性，沒有信號

這種情況較少見，主要原因是封閉液中含有能與一抗（或二抗）發(fā)生交叉反應的成分，抗體難以與目的蛋白結合。

免疫組織化學（IHC）與免疫細胞化學（ICC）的實驗流程高度相似，封閉操作位于樣本制備完成和一抗孵育之前。這一環(huán)節(jié)還可以細分為滅活和封閉兩步。滅活旨在消除細胞或組織中的內源性酶及其他活性物質，常用3%雙氧水室溫處理10min。封閉的核心目的是阻斷切片上的非特異性位點與抗體結合，常用3-5%的BSA或二抗同種屬的正常血清，室溫孵育30min。

滅活與封閉操作步驟

Step 1：將切片放入染色缸中，浸入3%過氧化氫溶液中10min

Step 2：用0.1% TBS-Tween（即TBST）洗片3次

Step 3：用無塵紙擦干組織切片周圍的水漬，用免疫組化筆在組織周圍畫圈，組織與圈線之間保留一定間隙

Step 4：畫圈后，切片立即在0.1% TBST中快速浸洗一次

Step 5：每片加3-5滴封閉液，室溫孵育15-30min。置于裝有去離子水的濕盒中，滴加封閉液后立即蓋緊

三、封閉到底在封什么？

封閉的本質是通過添加惰性蛋白或試劑，占據(jù)樣本中潛在的非特異結合位點。理想的封閉液應具備：能封閉所有非特異性位點，同時不掩蓋表面上的靶蛋白、不結合靶蛋白表位、不與抗體或檢測試劑發(fā)生交叉反應。IHC實驗通常包含一個或多個封閉步驟，包括非特異封閉、生物素封閉、內源酶封閉、自發(fā)熒光封閉，以降低背景信號并減少假陽性。

根據(jù)IHC實驗的不同需求，封閉可分為四大類型，每種都有其特定的應用場景：

1封閉非特異性位點

這是封閉的“核心使命”。樣本中的非特異性結合主要由疏水作用或離子相互作用介導，封閉液中的蛋白能夠與這些非特異性位點結合，降低抗體與非靶蛋白的結合幾率。理論上，不與靶抗原或檢測中使用的抗體及其它檢測試劑發(fā)生特異性結合的蛋白質都可以用于封閉。但在實驗操作中，一些蛋白在中性pH條件下更容易發(fā)生非特異性結合，因此常用于封閉，如正常血清、牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉等，酪蛋白、明膠等也可用作封閉液。封閉液一般用PBS、PBST或者TBST進行稀釋。

典型非特異性染色案例

A. 小鼠肺組織中性粒細胞出現(xiàn)Ki67抗體非特異性染色

B. 大鼠子宮組織肥大細胞非特異性染色

C-D. 小鼠腸道固有層漿細胞棕色染色（省去一抗僅加二抗仍有信號，確認為非特異性結合）

非特異性染色的典型案例。A小鼠肺組織的中性粒細胞出現(xiàn)Ki67抗體的非特異性染色；B大鼠子宮組織肥大細胞出現(xiàn)非特異性染色；C-D小鼠腸道組織中固有層漿細胞出現(xiàn)棕色，省去一抗僅加二抗仍有棕染，確定存在非特異性染色。箭頭所指為非特異性染色。（圖片源自Kyathanahalli S. Janardhan et al. 2018. doi:10.1177/0192623318776907）

2滅活內源性過氧化物酶

肝臟、腎臟及其它血管豐富的組織中，內源性過氧化物酶活性較高。若使用HRP標記二抗進行檢測，這些內源酶會與其反應，導致背景信號飆升。為有效阻斷這一干擾源，常規(guī)做法是在封閉前用3%-10%的過氧化氫溶液處理切片，徹底滅活內源性過氧化物酶活性。

討論：

部分文獻建議在二抗孵育前進行滅活。您認為哪一步進行更合理呢？

封閉過氧化物酶對減少非特異性染色的影響。A和B分別為未封閉和封閉過氧化氫酶的腎臟組織切片；C和D分別為未封閉的脾-臟和肝臟組織切片，箭頭所指為非特異性染色。（圖片源自Kyathanahalli S. Janardhan et al. 2018. doi:10.1177/0192623318776907）

3滅活內源性堿性磷酸酶

若使用堿性磷酸酶（AP）標記二抗進行檢測，需先評估樣本中是否存在內源性堿性磷酸酶。如腎臟、腸道、成骨細胞等組織及冷凍樣本通常具有較高的內源性堿性磷酸酶活性。判斷方法簡單：設置省去一抗和二抗孵育的空白對照，僅將樣本與底物孵育。如果樣本出現(xiàn)著色即需要進行滅活處理。鹽酸左旋咪唑或鹽酸四咪唑等AP抑制劑是常用的滅活試劑。

重點提醒：使用AP標記二抗進行檢測時，所有后續(xù)步驟（包括封閉、一抗/二抗稀釋、洗滌）都應使用TBS緩沖體系，嚴禁使用PBS，因為PBS中的磷酸鹽會強烈抑制堿性磷酸酶的活性，導致無信號或信號極弱。

4封閉內源性生物素

當采用ABC法或LSAB法進行IHC實驗時，會使用生物素標記的二抗。內源性生物素同樣會與檢測體系發(fā)生反應，引發(fā)假陽性。因此在檢測肝臟、腎臟等含有較高水平內源性生物素的組織時，建議使用親和素/生物素預處理。

解決方案：先用親和素封閉內源性生物素，隨后需加入生物素進行孵育，以封閉親和素分子上剩余的生物素結合位點，避免干擾后續(xù)檢測。

封閉類型速查表：

四、封閉問題的診斷與排查

當IHC出現(xiàn)無信號結果時，如何快速判斷是封閉所致的呢？以下兩組對照實驗助你鎖定問題根源：

1，無封閉組

省去封閉步驟，其余操作保持不變。如果該組有信號且背景較高，說明原方案存在封閉過度的問題，需要優(yōu)化封閉液的濃度和孵育時間。如果該組仍然沒有信號，則問題不在封閉，需排查抗原修復、一抗效價等環(huán)節(jié)。

2，更換封閉液

將原封閉液換成其他類型，如將脫脂奶粉換成BSA。如果實驗信號恢復正常，則說明原封閉液存在種屬交叉反應或變質。

通過這兩組簡單的對照，您可以快速排除或確認封閉因素，避免在抗體稀釋、抗原修復等步驟上盲目摸索，節(jié)省實驗時間和費用。

五、讓封閉成為IHC成功的助推器而非絆腳石

回顧全文，封閉操作并非簡單的“按流程走”，而是需要綜合考量靶蛋白類型、豐度、定位及顯色檢測方法。成功的封閉策略應涵蓋以下三個要素：

1，匹配性：

封閉液的種類、濃度須與二抗來源、酶標二抗種類、靶蛋白特性高度契合，形成精準匹配。AP系統(tǒng)忌用PBS，生物素系統(tǒng)慎用脫脂奶粉，多重染色需要根據(jù)一抗種屬組合，選擇相應的正常血清混合使用。

2，針對性：

不同組織的內源性干擾物存在差異，需要提前了解樣本特性，制定專屬的封閉方案。

3，靈活性：

根據(jù)預實驗結果及時調整封閉策略，背景高則延長封閉時間或提高封閉液濃度，信號弱則嘗試更好封閉液或優(yōu)化封閉時間和濃度。

基于以上原則，一些特殊的靶蛋白需要特殊對待：

如EGFR、HER2、PD-L1等膜蛋白或受體蛋白，暴露的表位有限，強封閉會遮掩胞外結構域，推薦使用3-5% BSA或低濃度血清，時間控制在30min，可視具體情況縮短。

表達豐度低的蛋白要縮短封閉時間或降低封閉液濃度，并增加洗劑強度。優(yōu)化封閉可避免靶蛋白信號被過度抑制，增加洗劑次數(shù)可減少非特異性結合，在信號和背景間達到平衡。

對于核蛋白或轉錄因子來說，出現(xiàn)核區(qū)泛染的可能性較高。建議在封閉液中添加低濃度的去污劑，增強封閉的針對性，減少核區(qū)非特異性結合。

血清中含有大量的分泌蛋白和細胞外基質（ECM）蛋白，易引發(fā)交叉反應。在檢測分泌蛋白或ECM蛋白時，推薦使用BSA或無蛋白商業(yè)化封閉液。

血清中的糖基成分易干擾抗體或凝集素與靶蛋白結合，在對糖基化蛋白或細胞表面糖蛋白進行檢測時，優(yōu)先選用BSA或化學封閉劑，避免糖基交叉反應。

END

封閉這一看似“無足輕重”的步驟常常被科研人員所忽略，他們寧愿花費大量的時間和精力投入到調整抗體稀釋比例、優(yōu)化抗原修復等環(huán)節(jié)，也不愿在封閉上“駐足10分鐘”。然而，IHC實驗的成功建立在對每一個環(huán)節(jié)的精細把控上。封閉正是阻斷非特異性結合、區(qū)分信號與噪音的關鍵。

充分理解封閉操作的原理及作用機制，建立系統(tǒng)的優(yōu)化策略，才能有效避免假陽性、假陰性、高背景等常見困擾，讓IHC技術成為蛋白定位研究中真正的可靠工具。好的實驗，始于對細節(jié)的尊重。

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