在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）利用一種特殊的緩沖液（兩性電解質(zhì)）將一個pH梯度制造而成，電泳時每種蛋白質(zhì)將在等于其等電點（pI）的pH處（此時此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負電荷）聚集從而使得一個很窄的區(qū)帶形成的一種電泳方法，就是等電聚焦電泳（Isoelectric focusing (IEF), also known as electrofocusing）。

基本原理

在IEF的電泳中，從陽極到陰極分布著具有pH梯度的介質(zhì)，pH值逐漸增大。兩性解離及等電點的特征為蛋白質(zhì)分子所具備。如此，在堿性區(qū)域，帶負電荷的蛋白質(zhì)分子向陽極移動，直至某一pH位點時電荷失去了而使移動停止，這個地方介質(zhì)的pH正好和聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點（pl）相等。同理，在酸性區(qū)域，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子直到它們的等電點上聚焦為止。由此可知，在此方法中，蛋白質(zhì)組分的特性量度為等電點，在有pH梯度的凝膠介質(zhì)中加入等電點不同的蛋白質(zhì)混合物，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分在在各自等電點相應(yīng)的pH位置上聚焦，從而使得分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶形成。

載體介質(zhì)

如果兩性電解質(zhì)載體足夠理想，那么其在pI處的緩沖能力及電導(dǎo)足夠，前者使pH梯度的穩(wěn)定得到保證，后者允許通過一定的電流。為了使整個體系的電導(dǎo)均勻，不同pI的兩性電解質(zhì)的電導(dǎo)系數(shù)應(yīng)該相似。兩性電解質(zhì)的分子量要小，如此，就能夠很容易地應(yīng)用分子篩或透析方法分開其與被分離的高分子物質(zhì)，并且不應(yīng)該使其變性和被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。

梯度組成

pH梯度有人工pH梯度和天然pH梯度二種pH梯度組成方式，因為人工pH梯度重復(fù)性差，和不穩(wěn)定，所以現(xiàn)在已經(jīng)看不見使用了。天然pH梯度的建立是將等電點彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物在水平板或電泳管正負極間引入，將酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等在正極端引入，將堿液，如氫氧化鈉、氨水等負極端引入堿液。

開始電泳前，兩性電解質(zhì)的混合物pH為一均值，就是各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示。當開始電泳后，帶負電荷Z多的為混合物中pIZdi的分子，pI1為其等電點，向正極移動速度Z快，當移動到正極附近的酸液界面時，pH突然下降，甚至和PI1接近或者比PI1還稍低，這一分子不再向前移動而是在此區(qū)域內(nèi)停留。因為兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力，從而保持其周圍一定的區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH在它的等電點范圍。第二種兩性電解質(zhì)pH稍高，其等電點為pI2，也向正極移動，因為pI2>pI1，所以定位于diyi種兩性電解質(zhì)之后，如此，經(jīng)過一定時間后，按各自的等電點具有不同等電點的兩性電解質(zhì)依次排列，使得從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度形成。