鐵硫簇（iron–sulfur cluster，鐵硫簇）是生物演化過程中最 早出現(xiàn)的、介導氧化還原反應的一類蛋白輔助因子，廣泛存在于線粒體、細胞質(zhì)及細胞核蛋白中，對 DNA 復制與修復、線粒體呼吸、蛋白翻譯及鐵穩(wěn)態(tài)維持等生命過程至關重要。在哺乳動物中，鐵硫簇合成障礙與多種遺傳性疾病密切相關，而鐵硫簇生物合成的上游調(diào)控機制，尤其是是否存在未知線粒體因子參與該合成代謝過程，至今尚未被完全闡明。

2025 年 12 月 18 日，清華大學基礎醫(yī)學院朱佳俊課題組聯(lián)合中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所潘巍峻課題組，在《Molecular Cell》期刊（IF=19.3）發(fā)表題為 “The TIM22 carrier translocase supports cell proliferation by facilitating mitochondrial iron uptake for Fe-S biogenesis” 的研究論文。該研究首次發(fā)現(xiàn)線粒體載體轉(zhuǎn)運酶復合體 TIM22 是鐵硫簇（Fe-S）生物合成的關鍵調(diào)控因子，其通過介導線粒體鐵轉(zhuǎn)運蛋白的正確定位，保障鐵硫簇合成所需鐵離子供應，進而支持細胞增殖。該研究為 TIM22 復合體亞基突變相關神經(jīng)肌肉癥等疾病的致病機理解析及臨床治療策略開發(fā)提供了全新線索。

整體研究策略

系統(tǒng)化篩選鐵硫簇生物合成調(diào)控的候選線粒體因子

構建體外細胞模型驗證調(diào)控因子作用

明確候選因子參與鐵硫簇合成的調(diào)控環(huán)節(jié)

驗證候選因子的體內(nèi)生物學功能

研究結果

鐵硫簇生物合成相關基因篩選系統(tǒng)：CRISPR 報告基因系統(tǒng)

圖 1. CRISPR 篩選流程圖。在表達 IRP2-EGFP 融合蛋白 HEK293T 細胞中，通過線粒體靶向 sgRNA 文庫開展 CRISPR 基因敲除，若被敲除基因與鐵硫簇（Fe-S）生物合成相關，F(xiàn)BXL5 泛素連接酶（E3）活性會受抑制，進而導致 IRP2-EGFP 融合蛋白發(fā)生累積。借助流式細胞術分選并收集綠色熒光蛋白（EGFP）高表達的前 20% 細胞。通過 gRNA 測序獲得確定候選基因。

鐵硫簇生物合成通路候選調(diào)控因子：線粒體載體轉(zhuǎn)運酶復合體 TIM22

研究團隊通過 CRISPR 基因編輯及報告基因篩選實驗，發(fā)現(xiàn) TIM22 復合體組分（包括 TIMM29 和 TIMM10）可能參與了鐵硫簇生物合成代謝通路；通過構建基因缺陷細胞株，進一步發(fā)現(xiàn)這兩個復合體組分功能缺失會導致鐵硫簇生物合成受損。

圖 2.（左）候選基因火山圖。（右）Western Blot 分析 HEK293T 細胞系中 TIM 復合體組分（TIMM29 和 TIMM10）表達缺陷對鐵硫簇簇合成的影響。

線粒體電子傳遞鏈的正常功能依賴多種含鐵硫簇蛋白及其鐵硫簇的電子接受和傳遞能力，其中，鐵硫簇生物合成受損會影響電子傳遞鏈的功能。研究團隊采用了 Agilent Seahorse XFe 96 能量代謝分析儀對 TIM22 復合體組分缺陷的細胞氧氣消耗率 (OCR) 進行了測定，發(fā)現(xiàn)與對照細胞相比，TIM22 復合體組分缺陷細胞氧氣消耗率顯著下降，說明電子傳遞鏈功能受損，這與細胞中鐵硫簇生物合成受損一致。

圖 3. 通過 Seahorse 能量分析儀檢測 TIMM 復合體組分缺陷下 DLD1 細胞的氧耗率 (OCR)。細胞先后經(jīng)過下面三種藥物處理：ATP 合酶抑制劑寡霉素（Oligomycin）、氧化磷酸化解偶聯(lián)劑羰基氰-4 (三氟甲氧基)苯腙（FCCP）及電子傳遞鏈抑制劑魚藤酮 / 抗霉素 A（Rot/Anti-A）。

TIM22 復合體通過維持線粒體 Fe2? 攝取，促進鐵硫簇合成，進而支持細胞增殖

線粒體中鐵硫簇的生物合成需要以半胱氨酸形式存在的硫、亞鐵狀態(tài)的鐵、由 NADPH 攜帶的電子，以及作為保護性還原力來源的谷胱甘肽（GSH）。因此，研究團隊探究了 TIMM29 缺失情況下線粒體中半胱氨酸、鐵、NADPH 和 GSH 水平的變化，以闡明 TIM22 復合體對鐵硫簇生物合成的作用機制。研究團隊通過離心法亞細胞分級分離或基于免疫純化的快速線粒體分離方法（Mito-IP）富集線粒體，并通過 Agilent CG-MS 以及 Cytation 多功能微孔板檢測系統(tǒng)測量線粒體組分中的代謝物豐度。結果顯示，在平行對照實驗中，半胱氨酸營養(yǎng)限制培養(yǎng)、敲除線粒體膜谷胱甘肽轉(zhuǎn)運體 SLC25A39、或敲除線粒體 NAD 激酶 NADK2 后，線粒體中半胱氨酸、GSH 或 NADPH 的含量顯著降低。而 TIMM 復合體組分 TIMM29 缺失后，線粒體中半胱氨酸、GSH 或 NADPH 水平幾乎沒有變化。這些結果表明：TIM22 復合體功能缺失并不會損害線粒體中半胱氨酸、GSH 或 NADPH 的合成代謝通路。通過線粒體靶向亞鐵探針檢測發(fā)現(xiàn)，TIMM29 表達缺陷的細胞中線粒體鐵攝取能力降低。TIMM29 缺陷導致線粒體鐵攝取減少，且當異種 TIMM29 被重新導入后，這一缺陷可被挽救。

圖 4.（上）針對 HEK293T 中分離富集的線粒體，采用氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術（GC-MS）檢測半胱氨酸水平；（中）采用酶偶聯(lián)比色測定法檢測谷胱甘肽（GSH）與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的水平。（下）Fe2+ 攝入實驗及 HEK293T 細胞生長曲線。樣本包含 TIM22 復合體組分缺陷株及異源鐵離子轉(zhuǎn)運體回補株。

TIM22 復合體生物體體內(nèi)功能：維持紅細胞譜系細胞發(fā)育及骨骼肌生成

研究團隊利用 CRISPR 技術構建 TIMM22 復合體組分 Timm29 基因敲除斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)突變體存在形態(tài)異常且胚胎期致死；其鐵硫簇相關蛋白表達水平與對照組相比顯著下降。胚胎受 精后 30 小時即出現(xiàn)血流無色、尾部造血組織紅細胞減少等造血缺陷表型。此外，突變胚胎骨骼肌纖維線粒體易發(fā)生碎片化。異位表達稻米鐵離子轉(zhuǎn)運體 OsMIT 可恢復鐵硫簇蛋白表達水平，進而挽救突變體的造血細胞譜系發(fā)育及骨骼肌發(fā)育缺陷。上述結果也證實“TIM22 - 線粒體鐵攝取 - 鐵硫簇合成” 調(diào)控軸的功能在脊椎動物中高度保守。

圖 5. 在斑馬魚發(fā)育過程中，TIM22 復合體的核心功能是維持線粒體鐵攝取，以保障鐵硫簇的生物合成。

結論與展望

研究團隊借助 CRISPR 報告基因篩選系統(tǒng)，篩選獲得鐵硫簇生物合成通路的候選調(diào)控因子 —— 線粒體載體轉(zhuǎn)運酶復合體 TIM22，并體外細胞實驗證實該復合體通過維持線粒體 Fe2? 攝取促進鐵硫簇合成，進而支撐細胞增殖；最后研究團隊通過斑馬魚模型證實該復合體在體內(nèi)具有維持紅細胞譜系細胞發(fā)育及骨骼肌生成的功能。

在本研究中，Agilent CG-MS 氣相質(zhì)譜、Seahorse 能量代謝分析系統(tǒng)、Cytation 多功能微孔板檢測儀及其他分析檢測平臺，助力研究團隊交叉驗證了 TIM22 復合體在線粒體鐵硫簇合成中的關鍵調(diào)控作用，并確認了維持線粒體鐵攝取這一調(diào)控機制，為 TIM22 相關遺傳病的治療提供了新線索及策略。

標簽：安捷倫