研究背景

聚山梨酯，商品名吐溫，親水性和化學穩(wěn)定性強，添加到藥物制劑中，可提高活性成分的溶解度，或者通過抑 制大分子蛋白藥物的自行聚集來提高蛋白藥物的穩(wěn)定性。目前抗體制劑配方中，吐溫 20 和吐溫 80 是Z常用的表面活性劑類輔料。

理論上，吐溫是脫水山梨醇聚氧乙烯與脂肪酸的單酯化產(chǎn)物，其中吐溫 80 主要成分為油酸酯，而吐溫 20 中有月桂酸酯和肉豆蔻酸酯等多種脂肪酸酯成分，吐溫 20 和吐溫 80 的理論聚合度均為 20（結(jié)構(gòu)見圖 1）。而實際工業(yè)生產(chǎn)中，吐溫合成要經(jīng)過一系列復雜的聚合反應，因而吐溫產(chǎn)品本身是一系列組分的混合物。有報道稱，吐溫中的某些組分，如聚氧乙烯異山梨醇酐一油酸酯（PIM），可能與注射劑的不良反應有關。生物制劑中，在緩沖溶液的 pH 值、金屬離子、活性酶等影響下，吐溫可能發(fā)生氧化和水解等降解反應。吐溫降解不僅會造成吐溫含量的降低，還會產(chǎn)生游離脂肪酸，可能導致生物制劑中出現(xiàn)不溶性微粒等問題，從而對藥品的安全性和有效性造成深遠的影響。

為了更好地評估吐溫質(zhì)量和更早地發(fā)現(xiàn)制劑中吐溫成分的變化，我們開發(fā)了一種基于 LC-Q/TOF  AIM 模式分析吐溫成分的方法。該方法結(jié)合 PolymerStudio 藥 用輔料智能分析軟件，無需專業(yè)質(zhì)譜經(jīng)驗，即可實現(xiàn)吐溫組成成分的自動化表征。為吐溫精細結(jié)構(gòu)分析和組成成分的深入探究，以及不同輔料間的比較分析，提供高效便捷和靈敏可靠的分析方法。

圖 1. 吐溫 20 和 吐溫 80 的理論結(jié)構(gòu)

方法概要

實驗采用反相色譜法，經(jīng)過前期色譜柱的篩選和流動相的優(yōu)化，使吐溫 20/40/60/80 中的各成分按照不同的結(jié)構(gòu)和聚合度進行初步分離，再結(jié)合高分辨質(zhì)譜進行表征。在此基礎上，研究者探索了吐溫中的理論成分，建立了保留時間數(shù)學模型，確認了不同成分的特征碎片離子，并開發(fā)了 PolymerStudio 藥 用輔料智能分析系統(tǒng)，用于自動解析聚合型輔料的質(zhì)譜信息。實驗人員僅需要按照 SOP 方法處理樣品并采集 LC-Q/TOF 數(shù)據(jù)，在 PolymerStudio 軟件中調(diào)用適當?shù)臄?shù)據(jù)庫，并簡單設置參數(shù)，即可實現(xiàn)吐溫類樣品成分的自動化表征，并可進行樣品間的對比研究。吐溫輔料樣品稀釋后直接檢測。大分子制劑可采用乙腈沉淀去除蛋白后再檢測，如需濃縮，建議氮吹后復溶。具體實驗條件參考前篇推送（見文末推薦閱讀篇）。

吐溫組成成分精細表征

圖 2 展示了某吐溫 20 樣本的 TIC 色譜圖及軟件分析結(jié)果。結(jié)構(gòu)簡單的吐溫組分，如聚氧乙烯（POE）、聚氧乙烯脫水山梨醇（PS）、聚氧乙烯異脫水山梨醇（PI），不同聚合度的化合物在色譜中有適度分離；稍微復雜一些的單酯，不同母核及脂肪酸酯的組分可以得到分離；對于二酯、三酯、四酯等高酯化組分，色譜層面難以完全分離，但可以觀察到保留時間變化的趨勢。軟件會利用加合離子、質(zhì)量偏差、特征碎片等信息，詳細分析每一種可能的成分及相對含量（精確到不同聚合度的每一個化合物），并根據(jù)不同樣品特點和統(tǒng)計需求，計算出整合后的結(jié)果，如不同亞類成分的相對含量、樣品平均聚合度和酯化度等。

圖 2. 吐溫 20 的成分表征（TIC 色譜圖及組分標識）

吐溫降解研究

在每個吐溫樣品精細表征定性分析的基礎上，也可對不同吐溫樣品進行組成成分的相對定量和對比分析。這種對比研究可用于不同廠家或者同一廠家不同批次的吐溫原料比較，也適用于吐溫降解通路的分析研究。

我們對蛋白制劑中的吐溫 20 加速降解進行了研究。從組成成分的精細表征結(jié)果看，辛酸單酯、癸酸單酯和月桂酸單酯的含量變化較小，肉豆蔻酸單酯和月桂酸單酯，油酸單酯的含量隨著反應時間延長而明顯降低。雙酯及更高酯化度的化合物，隨著反應時間延長，信號強度明顯減小甚至消失。下表展示了部分成分，包括未酯化成分和月桂酸酯的含量變化，聚氧乙烯（POE）、聚氧乙烯異脫水山梨醇（PS）、聚氧乙烯單月桂酸酯（PML）、聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯（PSML）、聚氧乙烯異脫水山梨醇單月桂酸酯（PIML）相對含量增加，而聚氧乙烯脫水山梨醇雙月桂酸酯（PSDL）、聚氧乙烯脫水山梨醇三月桂酸酯（PSTL）、聚氧乙烯脫水山梨醇四月桂酸酯（PSEL）、聚氧乙烯異脫水山梨醇雙月桂酸酯（PIDL）等高酯化物相對含量明顯降低，甚至無法檢出。

安捷倫與科邁恩以及中國醫(yī)學科學院/協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所共同推廣的 UHPLC-6500 系列 Q-TOF MS 結(jié)合 PolymerStudio 聚合物分析軟件的一體化解決方案，幫助解決了藥 用輔料質(zhì)量研究和質(zhì)量控制中的挑戰(zhàn)，加快了藥物制劑開發(fā)的進程，是制劑處 方篩選與工藝優(yōu)化過程中分析工作的有力武器。