目前，分析淋巴細胞介導的抗腫瘤細胞毒性的標準測定法是采用放射性同位素或熒光標記等終點分析法。然而，這樣的測定很難實現(xiàn)實時的分析。來自日本的科學家近日在STAR PROTOCOL發(fā)表了一種實驗方案:“A protocol for quantifying lymphocytemediated cytotoxicity using an impedance based real-time cell analyzer”，該方案使用無需標記、基于阻抗的實時細胞分析儀xCELLigence real-time cell analyzer (RTCA) 分析淋巴細胞介導的毒性。

xCELLigence RTCA系統(tǒng)無創(chuàng)傷且實時連續(xù)地測量細胞電阻抗，并通過軟件計算Z 終以細胞指數(shù)值展示結果。同時生成實時殺傷曲線，可用于實時量化淋巴細胞介導的細胞毒性。

實驗原理

xCELLigence RTCA的專用耗材E-Plates每個孔底部均嵌有陣列排布的微金電極生物傳感器。當靶細胞黏附到板底時會產(chǎn)生電阻抗， 每個孔的電阻抗被報告為細胞指數(shù)，它連續(xù)且無創(chuàng)地表示細胞數(shù)量的變化。如果懸浮的效應細胞（CAR-T, CAR-NK, Lymphocyte等）殺傷貼壁靶細胞，則檢測到相應的殺傷活性。每孔數(shù)據(jù)的連續(xù)采集同時生成多種條件下的實時殺傷曲線。

實驗步驟

STEP01：效應細胞的誘導 

1、按照1 x106 B16-F1細胞/mouse接種到兩只8w 的WT C57BL/6J小鼠，腫瘤平均直徑在兩周后可達到6mm；

2、Day-2：鋪板的B16-F1細胞融合率達到30%-50%時將培養(yǎng)基換成含有100U/ml IFN-γ的DMEM，然后繼續(xù)培養(yǎng)48h；

3、Day0: 接種兩周后收集小鼠脾 臟單個細胞，并按照40 x106脾 臟細胞與2 x106 B16-F1細胞（100U/ml IFN-γ預處理兩天）共培養(yǎng)5天。

STEP02:靶細胞的接種

1、Day2：鋪板的B16-F1細胞融合率達到30%-50%時將培養(yǎng)基換成含有100U/ml IFN-γ的DMEM，然后繼續(xù)培養(yǎng)48h；

2、Day4：37℃預熱培養(yǎng)基30min，打開儀器和軟件，并根據(jù)實驗要求設置軟件步驟，將50μl 培養(yǎng)基加入到RTCA E-plate中放到RTCA中并進行背景讀數(shù)。然后將處理好的B16-F1細胞按照0.5-2 x104 cells/100 μl加入到E-plate中。將板子15-25℃放置30min使細胞沉降到底部。然后將板子放在置于培養(yǎng)箱的RTCA儀器中進行實時監(jiān)測18–36 h，且設置每15min進行一次電阻讀取。

STEP03:效應細胞的添加

1、Day5：將誘導的脾 臟細胞作為效應細胞按照不同的效靶比（Effector:Target ratios = 12.5:1, 25:1, and 50:1）加入到E-plate的靶細胞中，將板子15-25℃放置30min使細胞沉降到底部。然后將板子放回RTCA儀器繼續(xù)進行實時監(jiān)測，且設置每15min進行一次電阻讀取(500 sweeps, 125 h)。

STEP04:效應細胞的添加

圖2.實驗流程圖

結果與討論

接種不同數(shù)量的B16-F1細胞(0.5x104, 1 x104，2 x104，4 x104cells/孔)，根據(jù)細胞指數(shù)增長反應細胞的增殖情況（圖3.A），同時通過RTCA軟件統(tǒng)計0-70h內(nèi)的斜率來反應細胞指數(shù)的變化率（圖3.B）。根據(jù)不同接種數(shù)量細胞的增殖曲線結果可以選擇合適的靶細胞接種量。

圖3. 使用 xCELLigence RTCA分析靶細胞的增殖

應用RTCA的殺傷試驗操作簡單，只需將2 x104個靶細胞（B16-F1）接種到每個孔中，靶細胞生長到平臺期大概28h時，按照不同效靶比（E:T，lymphocytes:B16-F1 細胞）加入效應細胞：100 x104，50 x104，25 x104 cells/孔（圖4.A），效應細胞對靶細胞的殺傷作用會導致細胞指數(shù)曲線的變化，且殺傷作用呈劑量依賴。同時RTCA軟件可輸出實時細胞殺傷數(shù)據(jù)的分析（圖4.B）。

圖4. 使用 xCELLigence RTCA分析效應細胞的殺傷

本文為大家介紹了一種應用xCELLigence RTCA系統(tǒng)來評估效應細胞殺傷的實驗方案，整體實驗流程簡單，操作簡便。同時作者在文中也提到不局限于效應細胞的類型，當然也不局限靶細胞類型的殺傷實驗應用。因此xCELLigence RTCA也可以應用到T細胞或者NK細胞等對腫瘤細胞的的殺傷評估，助力腫瘤研究。