核酸分離與純化的步驟 大多數(shù)核酸分離與純化的方法一般都包括了細(xì)胞裂解酶處理核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離核酸純化等幾個(gè)主要步驟每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn) 1. 細(xì)胞裂解:核酸必須從細(xì)胞或其他生物物質(zhì)中釋放出來(lái)細(xì)胞裂解可通過(guò)機(jī)械作用化學(xué)作用酶作用等方法實(shí)現(xiàn) (1) 機(jī)械作用:包括低滲裂解超聲裂解微波裂解凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法 (2) 化學(xué)作用:在一定的p H 環(huán)境和變性條件下,細(xì)胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相 (3) 酶作用:主要是通過(guò)加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細(xì)胞破裂,核酸釋放 2. 酶處理:在核酸提取過(guò)程中,可通過(guò)加入適當(dāng)?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解,以利于核酸的分離與純化如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì),滅活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸 3. 核酸的分離與純化:核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì)多糖脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性,根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異,用選擇性沉淀層析密度梯度離心等方法可將核酸分離純化(1) 酚提取/ 沉淀法:核酸分離的一個(gè)經(jīng)典方法是酚氯仿抽提法細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相,加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1 體積) 混合液(2) 層析法:層析法是利用不同物質(zhì)某些理化性質(zhì)的差異而建立的分離分析方法包括吸附層析親和層析離子交換層析等方法在內(nèi)的層析法因分離和純化同步進(jìn)行,并且有商品試劑盒供應(yīng),而被廣泛應(yīng)用于核酸的純化該法分離純化核酸,具有質(zhì)量好產(chǎn)量高成本低快速簡(jiǎn)便節(jié)省人力以及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn) (3) 密度梯度離心法:密度梯度離心也用于核酸的分離和分析 MSP-8600微波消解儀/MSP-8600微波萃取