【概述】

嬰幼兒遺傳性代謝病種類繁多，臨床表現(xiàn)常常是非特異性的，且多無明顯的神經(jīng)系統(tǒng)定位體征，只憑臨床表現(xiàn)往往很難診斷。醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不斷完善及提高，對(duì)嬰幼兒遺傳性代謝疾病的研究產(chǎn)生了很大的推動(dòng)作用。氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）檢測(cè)技術(shù)作為化學(xué)診斷方法，首先由K-Tanaka于1966年應(yīng)用于代謝性疾病的診斷，從1992年起該方法經(jīng)過多次改進(jìn)，目前用此方法同時(shí)篩查氨基酸、有機(jī)酸、糖代謝異常及脂肪代謝紊亂等一百多種疾病。本文采用賽默飛世爾科技氣質(zhì)聯(lián)用儀建立了嬰幼兒遺傳代謝病的快速篩查方法，方法準(zhǔn)確，敏感性高，特異性強(qiáng)，是篩查遺傳性代謝疾病的有效手段。

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；

柱溫：60℃（2 min），10℃/min到220℃（3 min），15℃/min到325℃（5 min）；

進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣，不分流時(shí)間：1min，

進(jìn)樣量：1 μL；

進(jìn)樣口溫度：250℃；

載氣：高純氦氣（99.999%），恒流模式，1.0 mL/min；

離子源溫度：280℃，傳輸線溫度：300℃，全掃描模式檢測(cè)，掃描范圍50-550

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

標(biāo)本收集：采用干燥潔凈的容器采集研究對(duì)象的新鮮尿液，本院樣本直接分裝到EP管，-20℃保存；外院樣本在浸透尿液收集專用濾紙片后，于干燥避光處陰干，密封后郵遞（耗時(shí)3-5天），寄到實(shí)驗(yàn)室后-20℃保存。

尿素酶預(yù)處理：取100μL尿液或尿?yàn)V紙片提取液，加入30μL尿素酶，37℃孵育30min。

上樣前處理將標(biāo)準(zhǔn)品溶液或經(jīng)過尿素酶處理的尿液樣本，加入內(nèi)標(biāo)十七烷酸（200ppm）及無水乙醇1000μL，充分混勻，13000rpm高速離心5min，將上清液移入色譜進(jìn)樣瓶，高純氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔锛尤?00μL BSTFA+TMCS（99 : 1），90℃孵育40 min，進(jìn)行三甲基硅烷化衍生化處理。待GC-MS分析。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

按上述條件對(duì)尿液樣品進(jìn)行前處理和氣質(zhì)聯(lián)用儀分析，檢測(cè)的化合物見表1。以各化合物的峰面積與肌酐的峰面積比值為判斷依據(jù)，超出正常值則視為異常。

表1.檢測(cè)的所有化合物的名稱、保留時(shí)間

利用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)遺傳性代謝?。↖MD）高危兒進(jìn)行尿液化學(xué)分析，結(jié)果411例IMD高危兒中檢測(cè)出代謝異常269例（65.5%），其中確診IMD19例（4.6%），包括甲基丙二酸血癥15例；丙酸血癥、高苯丙氨酸血癥、尿素循環(huán)異常和焦谷氨酸尿癥各1例；疑似IMD22例（5.4%），包括乳酸血癥13例原發(fā)性甘油尿癥5例，脂肪酸代謝異常4例，Citrin缺陷癥、絡(luò)氨酸血癥、半乳糖血癥、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥、楓糖尿癥各1例；其他代謝異常228例蔗糖、乳糖、半乳糖、N-乙酰絡(luò)氨酸、琥珀酸、雙羧酸（55.5%），表現(xiàn)為尿乳酸、蔗糖、乳糖、半乳糖、N-乙酰絡(luò)氨酸、琥珀酸、雙羧酸水平以及絲氨酸/蘇氨酸比例異常等。

圖1為實(shí)際樣品的檢測(cè)全掃描的總離子流圖。

圖1.尿液檢測(cè)結(jié)果總離子流圖（上圖為正常情況的尿液，下圖為甲基丙二酸（9.28min）血癥患兒尿液的檢測(cè)譜圖）

Tracefinder軟件可以方便的給出目標(biāo)物與肌酐的峰面積比值，如圖2所示。每個(gè)化合物與肌酐的峰面積比值（response ratio）列在計(jì)算結(jié)果中。該軟件還可以同時(shí)對(duì)化合物進(jìn)行定性確認(rèn)，如圖3所示，目標(biāo)物的定量離子和定性離子的提取離子譜圖分別列出，離子豐度比也都顯示在圖上。樣品中目標(biāo)物的全掃描譜圖與參考物的全掃描譜圖對(duì)比顯示在右下方，可幫助我們對(duì)目標(biāo)物進(jìn)一步定性確認(rèn)。

圖2. Tracefinder軟件計(jì)算結(jié)果

圖3. Tracefinder軟件定性結(jié)果瀏覽

結(jié)論

利用賽默飛世爾科技全新一代氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行小兒遺傳代謝病的篩查完全可行。尿液經(jīng)尿素酶處理后，衍生用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析，Tracefinder軟件可以直接給出需要的比值結(jié)果，操作簡(jiǎn)單方便。該方法用于411例IMD高危兒尿液篩查，篩查結(jié)果檢測(cè)出代謝異常269例。該方法準(zhǔn)確，敏感性高，特異性強(qiáng)，是篩查遺傳性代謝疾病的有效手段。

【儀器/耗材清單】

儀器

ThermoScientificTMISQ單四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，包括：

-TRACE 1310氣相色譜，配分流不分流進(jìn)樣口

-ISQ LT單四極桿質(zhì)譜

- AS1310自動(dòng)進(jìn)樣器

Thermo ScientificTMTraceFinder 3.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

恒溫干燥箱、離心機(jī)、天平、漩渦混合器、氮吹儀（ThermoScientific）

耗材

色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）（Thermo Scientific, PN 26098-1420）（Thermo Scientific）

試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

乙醇：色譜純(Thermofisher)；

衍生試劑BSTFA+TMCS(99 : 1)

尿素酶

十七烷酸

【參考文獻(xiàn)】

[1]彭薇,張萬巧,封志純.氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)遺傳代謝性疾病高危患兒.臨床兒科雜志2014 (09)