【概述】

       近年來(lái)基因毒性雜質(zhì)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，甲磺酸酯、苯甲磺酸等磺酸類物質(zhì)與微量的低級(jí)醇在合成反應(yīng)中生成烷基磺酸如甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、異丙基甲磺酸酯（IMS）、正丁基甲磺酸酯（NBMS），以及芳基磺酸酯如苯磺酸甲酯（MBS）、苯磺酸乙酯（EBS）、對(duì)甲苯磺酸酯（MP-TS），這些物質(zhì)可與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)，從而可能成為引發(fā)癌癥的誘因，因此控制藥物中該類雜質(zhì)的毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）水平非常重要，歐洲醫(yī)藥評(píng)價(jià)署（EMEA）發(fā)布了關(guān)于基因毒性雜質(zhì)的Zda攝取量為1.5μg/d。這些潛在基因毒性的存在引起管理機(jī)構(gòu)的高度重視，為防止奈非那韋事件的發(fā)生，EMEA首先實(shí)施詳細(xì)指南控制雜質(zhì)限度，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）隨后頒布指南草案，國(guó)際藥品注冊(cè)協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）也對(duì)基因毒性雜質(zhì)做出限度規(guī)定，《歐洲藥典》增補(bǔ)版7.3明確指出采用衍生化法檢測(cè)藥物中MMS、EMS、IMS（2.5.38）。

       甲磺酸酯基的存在可以使C—O鍵之間變的活潑，發(fā)生斷裂后生成碳正離子而具有烷化作用?；趯?duì)此認(rèn)識(shí)，人們開(kāi)始研究磺酸酯類化合物，希望找到有效的抗腫瘤藥物，從中發(fā)現(xiàn)了白消安（Busulfan，馬利蘭），其結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)甲磺酸基團(tuán)，為雙功能的烷化劑，可以與DNA中的鳥(niǎo)嘌呤集合，產(chǎn)生分子內(nèi)交聯(lián)，從而使腫瘤細(xì)胞死亡。臨床上對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病的LX顯著，主要的不良反應(yīng)為消化道反應(yīng)及骨 髓YZ。

       目前因基因毒性物質(zhì)的概念廣泛，所含種類繁多，對(duì)于磺酸酯類的物質(zhì)除去其治癌作用外，其它的性質(zhì)尚未探知，而其致癌致畸的作用卻是不可否認(rèn)的。對(duì)于歐洲藥典中采用衍生化法測(cè)定MMS、EMS、IMS，如果某藥品中含有甲基、乙基、異丙基類物質(zhì)，則該方法不可避免的存在其測(cè)定局限性，本方法主要提出了一種采用液體直接進(jìn)樣法分析藥物中8種磺酸酯的GCMS方法，方法快速、有效，靈敏度滿足對(duì)微量分析的要求。

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

儀器方法

進(jìn)樣口溫度：250℃；

進(jìn)樣模式：splitless，

不分流時(shí)間：1min；

進(jìn)樣體積：1μL，

載氣：氦氣，1.0 mL/min

柱溫：50℃（1 min），10℃/min到280℃（5 min）

離子源：溫度280℃，Transfer line : 280℃

掃描方式：SIM模式

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.05 g 8種磺酸酯于50 mL乙酸乙酯定溶制得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：取以上標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL。

樣品的前處理

提取：

可溶于有機(jī)溶液藥品：稱取某藥品0.05 g于試管中，準(zhǔn)確加入2 mL乙酸乙酯充分振蕩，超聲提取10 min。

水溶性藥品：稱取某藥品0.05 g于試管中，準(zhǔn)確加入2 mL甲醇：水（5 : 1）充分振蕩，超聲提取10 min，再以2 mL乙酸乙酯充分超聲提取，過(guò)無(wú)水硫酸鈉，以55℃氮吹致盡干，以2 mL乙酸乙酯定容。將以上處理液，過(guò)濾膜上GCMS分析。

加標(biāo)樣品的制備

將藥品研磨制成粉末，稱取該藥品0.5 g，加入40μL的10μg/mL、250μg/mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，混均，制得含8種磺酸酯0.8μg/g、20μg/g的加標(biāo)樣品。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

1.色譜柱的選擇

       磺酸酯類屬于極性物質(zhì)，易溶于水，在水存在下高溫條件易發(fā)生分解反應(yīng)，本方法根據(jù)極性首先選擇極性色譜柱分析。本方法中考察了Tg-Wax MS 30 m×0.25μm×0.25 mm和Tg-35 MS 30 m×0.25μm×0.25 mm，Tg-5 MS 30 m×0.25μm×0.25 mm三種極性不同的色譜柱。因本方法選擇液體直接進(jìn)樣，同時(shí)由于藥品基質(zhì)的復(fù)雜多樣性極易導(dǎo)致較多的雜質(zhì)進(jìn)入色譜柱，如果長(zhǎng)時(shí)間低溫下做樣會(huì)導(dǎo)致色譜柱的污染。另外方法中甲苯磺酸酯類沸點(diǎn)較高，也不易選擇極性色譜柱。

當(dāng)選擇中等極性、非極性色譜柱時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選擇-5色譜柱分離效果較差，對(duì)甲苯磺酸甲酯、乙酯、異丙酯無(wú)法完全分離。

2.提取溶劑的選擇

       磺酸酯為藥物生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，本方法選擇某樣品測(cè)定，主要考察了乙酸乙酯、甲醇、乙腈、正己烷四種不同的溶劑的提取效率。對(duì)于可溶于有機(jī)溶劑的藥品，當(dāng)采用甲醇、乙腈做提取溶劑時(shí)，對(duì)藥品中8種磺酸酯的提取效率也較好，由于甲醇、乙腈極性溶劑對(duì)色譜柱的損傷大，易導(dǎo)致色譜柱流失，因此本方法采用乙酸乙酯做為提取溶劑。

部分藥品為水溶性藥品，且其僅在水中溶解性較好，此時(shí)針對(duì)這些藥品，本方法主要采用通過(guò)甲醇-水溶液進(jìn)行提?。? : 1），同時(shí)由于甲基磺酸甲酯、苯磺酸乙酯為微溶于水的，若直接以甲醇-水超聲提取后過(guò)無(wú)水硫酸鈉，該方法下此兩種物質(zhì)的回收率會(huì)受到影響，通過(guò)甲醇-水溶液（5 : 1）提取后，再以2 mL的乙酸乙酯進(jìn)一步超聲提取，可以達(dá)到更好的提取回收效率。

圖1. 1μg/mL 8種磺酸酯的T-SIM掃描圖。

3.標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及樣品加標(biāo)色譜

      磺酸酯為藥物生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，本方法的分析目標(biāo)物及其定性、定量離子如下表1。本方法選擇某樣品測(cè)定，其中未含有8種磺酸酯，且該藥品中無(wú)其它物質(zhì)對(duì)所分析物質(zhì)干擾，如下圖2為空白、某樣品及其加標(biāo)色譜圖。

4.線性、檢出限及RSD

       配制濃度分別為：10.0、20.0、50.0、100.0、200、500μg/L的校準(zhǔn)溶液，采用上述方法分別進(jìn)樣分析，考察各組分在10.0-500μg/L濃度范圍內(nèi)的線性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明8種組分在10.0-500.0μg/L線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大0.995（見(jiàn)表2）。

       對(duì)某樣品添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（加標(biāo)濃度為0.8μg/g、20μg/g），考察8種磺酸酯的加標(biāo)回收情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各組分的加標(biāo)回收率均在83.2-99.5%之間，符合日常分析檢測(cè)的要求。對(duì)0.8、20μg/g加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，平均RSD值在4.7-9.3%，符合穩(wěn)定性要求。同時(shí)以三倍信噪比計(jì)算各組分檢出限，各組分儀器檢出限在5.0-12.0μg/L（見(jiàn)表3）。

本方法能夠滿足歐洲藥典中對(duì)甲基磺酸甲酯、乙酯、異丙酯的限量要求，同時(shí)對(duì)于其它5種磺酸酯也可以做0.24μg/g。

表1.分析物保留時(shí)間及定性定量離子

圖2.空白、樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品加標(biāo)濃度為20μg/g的TIC圖，由上而下分別為空白、樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品加標(biāo)

表3.線性、檢出限及RSD數(shù)據(jù)（n=6）

5.方法的優(yōu)勢(shì)

在EP的方法中對(duì)于甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、異丙基甲磺酸酯（IMS）采用衍生化法得到碘甲 烷、碘乙烷、碘異丙烷通過(guò)頂空方式進(jìn)行分析衍生產(chǎn)物來(lái)對(duì)原藥品中MMSEMSIMS的量此方法存在一定的局限性當(dāng)藥物中含有易與碘形成碘代烷的其他類型化合物時(shí)造成假陽(yáng)性如下圖某藥品中并未檢出甲基磺酸酯采用EP方法測(cè)得其中含中甲基磺酸乙酯（0.8μg/g）、異丙酯（2.6μg/g），均已超過(guò)本方法的定量限，因藥品中可能含有某種乙基、異丙基化合物而使其測(cè)得結(jié)果含有碘乙烷、碘異丙烷。另外對(duì)于EP方法中采用頂空衍生法，其衍生過(guò)程需配制衍生化試劑進(jìn)行衍生，過(guò)程繁多復(fù)雜，易造成偏差。本方法采用液體法直接進(jìn)樣法，前處理簡(jiǎn)單也是此方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)。

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用賽默飛世爾科技Trace1300GC配ISQ質(zhì)譜檢測(cè)器分析藥品中的8種基因毒性物質(zhì)——磺酸酯，樣品通過(guò)乙酸乙酯超聲提取可以完成藥品中磺酸酯的萃取。同時(shí)對(duì)于EP方法中提出的頂空衍生化方法，其本身存在一定的局性限，本方法通過(guò)直接進(jìn)樣分析目標(biāo)物，可以去除假陽(yáng)性的影響，滿足檢測(cè)要求，本方法準(zhǔn)確，靈敏度高。

【儀器/耗材清單】

儀器

? TraceFinder 3.2

? Thermo ScientificTM Trace 1310-ISQ, SSL進(jìn)樣口, AS1310自動(dòng)

進(jìn)樣器

?色譜柱：TG-35 MS, 30 m, 0.25 mm, 0.25μm  P/N: 26094-1420;

S/N: 1082682

?進(jìn)樣針：10μL

試劑與標(biāo)準(zhǔn)品耗材

HPLC級(jí)乙酸乙酯、甲醇、無(wú)水硫酸鈉、8種甲基磺酸酯標(biāo)準(zhǔn)品。

【參考文獻(xiàn)】

[1]張園園，李銀峰，王杰晶乖.藥物中痕量磺酸酯類物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展藥物評(píng)價(jià)研究，2012,35 (4): 304-208.

[2] Graham E.Taylor, Mark Gos領(lǐng), Andrea Pearce Low level determination of p-toluensulfonate and benzenesulfonate estersin drug substance by high performance liquid chromatograpy/mass spectormetry．2006, (1119):231-237

[3] Roberto Alzaga , Robert W. Ryanb. A generic approach for the determination of residues of alkylating agents in activepharmaceutical ingredients by in situ derivatization–headspace–gas chromatography–mass spectrometry．2007, (45):472-479

[4] European Pharmacopoeia 8.0.2.5.38，MMS,EMS and IMS in active substances