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2025-01-21 09:30:22反相苯基柱: 反相苯基柱是一種常用的液相色譜柱，其固定相表面鍵合有苯基官能團(tuán)，具有疏水性。這種柱子適用于分離中等極性到非極性的化合物，特別適用于在反相色譜條件下對(duì)芳香族化合物進(jìn)行分離。反相苯基柱具有分離效率高、選擇性好、化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。

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 東曹（上海）生物科技有限公司 1575
2021-03-26
反相苯基柱

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反相苯基柱問答

2025-04-14 18:30:13反相液相色譜蛋白質(zhì)原理是什么？: 反相液相色譜（Reverse Phase Liquid Chromatography, RPLC）是一種基于疏水相互作用的高效分離技術(shù)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)及多肽的分離、純化與分析。其核心原理在于固定相與流動(dòng)相的極性差異，以及樣品分子與固定相之間的疏水分配效應(yīng)。以下將從分離機(jī)制、蛋白質(zhì)特異性行為、固定相與流動(dòng)相選擇、應(yīng)用場(chǎng)景等角度展開說明。反相色譜的固定相通常由疏水性材料（如C18、C8或C4鍵合硅膠）構(gòu)成，而流動(dòng)相為極性溶劑（如水、甲醇或乙腈）。分離過程中，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域與固定相發(fā)生非共價(jià)結(jié)合，極性較強(qiáng)的分子優(yōu)先被流動(dòng)相洗脫，疏水性更強(qiáng)的分子則因保留時(shí)間延長(zhǎng)而實(shí)現(xiàn)分離。梯度洗脫是優(yōu)化分離效果的關(guān)鍵手段，通過逐步增加有機(jī)溶劑比例削弱疏水作用，從而按疏水性差異依次洗脫目標(biāo)分子。蛋白質(zhì)在反相色譜中的行為具有特殊性。由于流動(dòng)相中常添加三氟乙酸（TFA）等離子對(duì)試劑，蛋白質(zhì)可能發(fā)生部分去折疊，暴露出內(nèi)部疏水殘基，增強(qiáng)與固定相的相互作用。此外，低濃度TFA可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成伸展構(gòu)象，導(dǎo)致其在死時(shí)間前洗脫；而高濃度TFA通過形成離子對(duì)使蛋白質(zhì)構(gòu)象緊湊（如“熔融球體”），延長(zhǎng)保留時(shí)間。這種構(gòu)象敏感性使反相色譜不僅能分離蛋白質(zhì)，還可用于研究其構(gòu)象穩(wěn)定性與表面疏水性。固定相的選擇需綜合考慮蛋白質(zhì)大小與疏水性。C18和C8適用于小分子肽段，而C4因較短的烷基鏈更適合大分子蛋白質(zhì)，避免過度保留。流動(dòng)相中，乙腈因低黏度和高洗脫能力成為首選有機(jī)溶劑，TFA則通過抑制硅醇基電離減少峰拖尾。梯度優(yōu)化需平衡分辨率與時(shí)間成本，例如降低最大有機(jī)溶劑濃度可改善峰分離，但可能延長(zhǎng)分析周期。在應(yīng)用層面，反相色譜憑借高分辨率與質(zhì)譜兼容性，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具。其典型場(chǎng)景包括：多肽藥物的純度分析、酶解產(chǎn)物的肽圖繪制、翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化）的檢測(cè)，以及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。例如，與質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)，反相色譜可分離復(fù)雜肽段混合物，通過質(zhì)譜鑒定實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的高通量解析。此外，其在治療性抗體表征中的應(yīng)用也日益增多，尤其在檢測(cè)聚集體與降解產(chǎn)物方面表現(xiàn)卓越。操作參數(shù)的設(shè)置直接影響分離效能。流速需根據(jù)色譜柱內(nèi)徑與填料粒徑調(diào)整，通常內(nèi)徑4.6mm的C18柱推薦流速為1mL/min。壓力上限需控制在柱耐受范圍內(nèi)（通?！?000psi），以避免固定相塌陷。檢測(cè)方法方面，紫外檢測(cè)（280nm）依賴蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的吸收，而質(zhì)譜聯(lián)用可提供分子量及結(jié)構(gòu)信息，靈敏度更高。總之，反相液相色譜通過疏水相互作用與動(dòng)態(tài)梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的高效分離與分析。其獨(dú)特的構(gòu)象敏感性、靈活的固定相選擇及與質(zhì)譜的兼容性，使其在生物醫(yī)藥與基礎(chǔ)研究中不可或缺。未來，隨著新型固定相（如表面多孔顆粒）與微流控技術(shù)的發(fā)展，反相色譜在蛋白質(zhì)分析中的分辨率與通量將進(jìn)一步提升。

2019-05-30 11:05:57ACE反相系統(tǒng)性方法開發(fā)方案: 使用ACE方法開發(fā)工具包(MDKs)進(jìn)行色譜柱篩選方法開發(fā)的四個(gè)簡(jiǎn)化步驟? ACE MDKs包括了為互補(bǔ)選擇性而精心設(shè)計(jì)的3支色譜柱。? 色譜柱篩選是一種簡(jiǎn)單而又功能強(qiáng)大的方法, 可以快速識(shí)別Z合適的色譜柱。? 通過篩選2種不同的流動(dòng)相有機(jī)改性劑可以使方法更全面。? 以下的流程圖總結(jié)了如何通過4個(gè)簡(jiǎn)單步驟執(zhí)行方法開發(fā)篩選。開始diyi步：選擇流動(dòng)相pH和緩沖液根據(jù)分析物性質(zhì) (即pKa, logP和logD數(shù)據(jù)) 進(jìn)行選擇。對(duì)于未知分析物，使用酸性流動(dòng)相作為起點(diǎn)。第二步：使用ACE 方法包 (3或6支色譜柱)梯度掃描以MeOH和MeCN作為有機(jī)溶劑,進(jìn)行5-95％梯度篩選。第三步：查看數(shù)據(jù) 選擇Z佳色譜柱和有機(jī)改性劑。第四步：方法優(yōu)化如有必要, 檢查溫度, pH值, 梯度斜率,梯度范圍等。是否實(shí)現(xiàn)分離？是-方法開發(fā)完成否-改變流動(dòng)相條件（pH值,緩沖液等），回到第二步繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。選擇色譜柱和粒徑尺寸。由LC系統(tǒng)和用戶的偏好決定。對(duì)于400 bar的HPLC系統(tǒng)來說, 5μm 150 x 4.6mm是個(gè)不錯(cuò)的選擇。對(duì)于600 bar優(yōu)化的HPLC系統(tǒng), 可使用2 和3μm粒徑的較短色譜柱 (如100mm)。1.7μm粒徑的短柱 (如50mm)適用于UHPLC系統(tǒng)。如何確定合適的篩選梯度時(shí)間？梯度時(shí)間可以使用公式1計(jì)算。VM可用公式2計(jì)算。tG = 梯度時(shí)間 (mins.) k* = 梯度保留系數(shù) (通常設(shè)置約為5)ΔΦ = 梯度范圍 (即對(duì)于5-95％B梯度，ΔΦ= 0.9) VM = 柱內(nèi)體積 (mL) S = 5 對(duì)于小分子 (＜1000沓)F = 流速 (mL/min) L = 色譜柱長(zhǎng)度 (mm) dc = 柱內(nèi)徑 (mm）請(qǐng)務(wù)必記住在下一次注射前, 在梯度洗脫后以至少10倍VM (柱內(nèi)體積) 進(jìn)行一次等度重新平衡。為何使用色譜柱篩選？ ? 改變色譜柱的固定相可能對(duì)選擇性造成顯著影響 (圖1)。? 在相同的流動(dòng)相條件下, 篩選不同的色譜柱可以幫助您以更高的分辨率更快地實(shí)現(xiàn)所需的分離。圖1：改變色譜柱固定相的影響。色譜柱：50x2.1mm 流動(dòng)相：A = 0.1％甲酸的水溶液，B = 含0.1%甲酸的甲醇:水(9:1 v/v) 梯度：5分鐘內(nèi)3-B，流速：0.06mL/min 溫度：40°C 檢測(cè)：UV，254nm 樣品：1）甲硝唑，2）芐醇，3）氫氯噻嗪，4）香草醛，5）羥苯甲酯，6）1,2-二硝基苯 ? ACE MDKs將具有不同相互作用機(jī)制的色譜柱組合在一起, 以Z大限度地提高選擇性并增加分離具有挑戰(zhàn)性的混合物的可能性。? 性價(jià)比高, ACE MDKs與單支色譜柱價(jià)格相同！? 兩種Z受歡迎的ACE反相 (RP) MDK (參見下表) 包括了為利用不同的保留機(jī)制和Z大化選擇性而獨(dú)特設(shè)計(jì)的相。? 所有六個(gè)相都可以在反相 (RP) 條件下使用, 并且具有與C18一樣的穩(wěn)定性。 1近似值– 通過半定量機(jī)制加權(quán)和/或通過參考使用>100特征分析物的其他ACE相來確定。 ? 其他的ACE方法包還有HILIC分析包, 生物大分子300?分析包和實(shí)心核(UltraCore) 分析包? 同樣提供微孔柱尺寸 (內(nèi)徑0.5和1.0mm)。成功范例對(duì)乙酰氨基酚及有關(guān)物質(zhì) ? 基于分析物的pKa和logD來選擇流動(dòng)相pH值。? 使用MeOH或MeCN作為Z常見的方法開發(fā) (C18）的起點(diǎn)無法分離所有的分析物。所以, 需要進(jìn)一步的方法開發(fā)。? 使用6支色譜柱/2次流動(dòng)相篩選, 即刻就可識(shí)別6種方案。? 無須進(jìn)一步的方法開發(fā)了！條件：色譜柱: 2 μm 100 x 3.0mm流動(dòng)相:A = 20mM 乙酸胺 pH6.0B = 有機(jī)溶液含有 (20mM 乙酸胺 pH6.0):水 (9:1 v/v)梯度：10分鐘內(nèi)5-95%B流速：1.2 mL/min柱溫：40 °C進(jìn)樣體積：2 μL樣品：1）對(duì)乙酰氨基酚 (撲熱息痛)2）4-氨基苯酚3）對(duì)苯二酚4）2-氨基苯酚5）2-乙酰胺基苯酚6）苯酚7）4-硝基苯酚8）2-硝基苯酚9）4-氯乙酰 ACE反相系統(tǒng)性方法開發(fā)方案

2019-06-25 09:06:03蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南十: 蛋白質(zhì)純化RP-HPLC 是一種有效的蛋白質(zhì)/多肽純化工具。通過 RP-HPLC 法可以從雜質(zhì)中分離目標(biāo)蛋白/多肽，采集到的片段可用于進(jìn)一步研究，以及借助正交分析技術(shù)的分析，甚至可作為ZL藥物。在蛋白質(zhì)/多肽分析過程中，色譜條件優(yōu)化的目標(biāo)是優(yōu)化分辨率和保留時(shí)間。制備色譜法分離蛋白質(zhì)/多肽時(shí)，色譜條件的開發(fā)主要是三個(gè)參數(shù)的優(yōu)化（參見圖45）：產(chǎn)量是從色譜法每一步中得到的純化的目標(biāo)蛋白/多肽含量。高產(chǎn)量可提高純化過程的實(shí)用性，并降低成本。純度是從目標(biāo)產(chǎn)物中去除雜質(zhì)的程度。純度高有助于從后續(xù)分析中獲得更佳的數(shù)據(jù)或獲得高純度產(chǎn)物。通量用來衡量制備周期中純化的物質(zhì)量。高通量說明在給定的成本和時(shí)間內(nèi)獲得更多研究或分析用物質(zhì)，或更多原料藥，用于制藥領(lǐng)域。由于制備色譜的目的與分析色譜的目的不同，因此色譜條件優(yōu)化也不同。圖45. 在蛋白質(zhì)或多肽的制備純化中，通過尋求產(chǎn)量、純度及通量的Z佳平衡實(shí)現(xiàn)分離條件的優(yōu)化。樣品裝載在分析色譜中，將小樣品裝載到色譜柱上以確保加樣量不影響分辨率。如果樣品量過高，則峰會(huì)加寬，進(jìn)而分辨率會(huì)下降。在不發(fā)生峰展寬的情況下允許加載到色譜柱的樣品量（“樣品容量”）取決于柱的大?。ǜ戒浟斜盹@示了柱的大小和樣品容量）。制備色譜法純化蛋白質(zhì)/多肽時(shí)，通常會(huì)超出樣品容量，使柱“過載”，從而增加產(chǎn)量和通量（圖46）。當(dāng)允許一定的分辨率損失時(shí)，加載的樣品量可為樣品容量的10~50倍（附錄，Z大實(shí)際負(fù)載）。圖46中，盡管由于柱過載使得峰變寬，但峰形相對(duì)較好，說明嚴(yán)重過載在增加產(chǎn)量的同時(shí)還能保持純度，但目標(biāo)蛋白/多肽的損失不可避免。由于樣品過載，圖47中峰也同樣加寬。片段收集、分析和利用當(dāng)柱過載時(shí)，通常會(huì)拋棄起始峰和結(jié)尾峰。圖46中，對(duì)紅色區(qū)標(biāo)示的峰的中間區(qū)域進(jìn)行了收集。去掉了峰首和峰尾。這避免了分離度較差的雜質(zhì)峰的收集，增加了純度，但降低了產(chǎn)量。在制備色譜中，對(duì)幾種感興趣的峰進(jìn)行了片段收集，用于雜質(zhì)分析。圖46.在多肽純化示例中，制備分離包括柱的過載加樣，以增加產(chǎn)量。分辨率降低，為了增加純度必須拋棄峰首和峰尾，但產(chǎn)量稍微有所降低。基于分析結(jié)果，收集了少雜質(zhì)或無雜質(zhì)的片段，拋棄了峰首和峰尾附近雜質(zhì)較多的片段。收集和拋棄片段的選擇應(yīng)考慮純度和產(chǎn)量的平衡。例如，在不損失分辨率的情況下，4.6 x 250 mm的“分析”柱可用于純化少量多肽（Z多約200微克）。但為了增加產(chǎn)量和通量，同樣大小的柱Z多可純化10毫克，但會(huì)有一定的純度或產(chǎn)量損失。恰當(dāng)?shù)氖占暹x擇有助于實(shí)現(xiàn)純度和產(chǎn)量間的Z佳平衡。在制備色譜中，盡管ZD在樣品質(zhì)量，但樣品體積也可能會(huì)很大。盡管可采用樣品環(huán)和注射器，但通過將樣品“泵”至柱上可以注入更多樣品。將泵的吸入管置于樣品容器內(nèi)，樣品通過洗脫泵加載至色譜柱。當(dāng)有機(jī)溶劑濃度低（通常，樣品裝在水相中）且目的蛋白/多肽以有機(jī)溶劑梯度洗脫時(shí)，可通過這種方式裝入大量樣品。吸附劑粒徑分析色譜常用的吸附劑粒徑為5μm，制備色譜常用的吸附劑粒徑更大。尤其是加樣量超過樣品容量時(shí)（柱過載），柱效較分析色譜影響較小。當(dāng)柱過載時(shí)，大粒徑填充柱同小粒徑填充柱分離蛋白質(zhì)和多肽的效果一樣。因此，制備色譜常用10μm或以上粒徑的吸附劑。粒徑分布也往往更寬。不同于0.5μm或更窄的粒徑分布范圍，制備色譜的粒徑范圍更大，例如10~15μm。由于制備色譜柱反壓和成本更低，因此更傾向于采用大粒子。柱內(nèi)徑由于樣品容量很低，純化過程很少使用小孔柱（內(nèi)徑小于2mm）。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室純化采用細(xì)孔柱（內(nèi)徑約2mm）和分析柱（4.6 mm內(nèi)徑）。這種小規(guī)模制備分離的色譜條件通常與分析分離的色譜條件相同。需要大量蛋白質(zhì)/多肽時(shí)，采用10mm和22mm內(nèi)徑的柱子。1 mg蛋白質(zhì)或多肽的純化可采用10 mm柱子，5 mg純化可采用22 mm柱子。允許柱過載時(shí)，可純化更多蛋白質(zhì)/多肽，10mm柱Z多可純化50mg，22mm柱Z多可純化200mg。大量蛋白質(zhì)或多肽的純化采用50 mm、100 mm或內(nèi)徑更大的大內(nèi)徑柱子。50mm內(nèi)徑的柱上已知Z多可純化5克蛋白質(zhì)/多肽。柱長(zhǎng)與分析柱相比，制備柱往往相對(duì)較短。這是因?yàn)樵谥苽渖V法中，柱的總體積比柱長(zhǎng)更重要，特別是蛋白質(zhì)的分離。內(nèi)徑60cm、柱長(zhǎng)12-15 cm（“圓餅狀”柱）的色譜柱已應(yīng)用到蛋白質(zhì)ZL藥物的大規(guī)模純化中。由于在制備色譜法中，柱通常過載，且效益的重要性遠(yuǎn)不及產(chǎn)量、純度及通量重要，因此根據(jù)其實(shí)用性而非效益優(yōu)化柱尺寸。流動(dòng)相組成同分析色譜法一樣，采用10~22mm內(nèi)徑柱的小規(guī)模純化常用乙腈-TFA體系。大規(guī)模純化通常采用乙醇等溶劑替代乙腈，采用乙酸替代TFA。盡管采用這些溶劑作流動(dòng)相會(huì)降低分辨率，但它們更適合大規(guī)模使用，且分辨率的降低與柱過載固有的分辨率損失相同蛋白質(zhì)變性通常認(rèn)為反相色譜法會(huì)使蛋白質(zhì)變性，因此洗脫出來的蛋白質(zhì)不是天然蛋白，且可能不具備生物活性。盡管反相HPLC的操作條件會(huì)使蛋白質(zhì)變性，但洗脫后仍可獲得天然、具有生物活性的蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑可能減弱疏水力，造成蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的損失。吸附劑的疏水面也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的去折疊。但與色譜分離時(shí)間相比，蛋白質(zhì)去折疊通常較慢，且蛋白質(zhì)在反相色譜分離期間僅發(fā)生輕微變性。由于二硫鍵的作用，蛋白質(zhì)保持球形結(jié)構(gòu)，且僅發(fā)生部分去折疊，因此從反相柱洗脫出的蛋白質(zhì)通?？赏ㄟ^在恰當(dāng)?shù)闹卣郫B緩沖液中處理，從而恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)而恢復(fù)至天然狀態(tài)。目前有許多實(shí)例均顯示采用反相HPLC純化后的蛋白仍維持天然三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性。胰蛋白酶的反相純化，其中活性得到了保留，且隨后用于蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶切。重組人紅細(xì)胞生成素是一種成功商業(yè)化的蛋白質(zhì)ZL藥物，采用了反相GX液相色譜法將蛋白藥物從其細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)中分離出來。采用反相HPLC對(duì)另一種商業(yè)蛋白質(zhì)ZL藥物——粒細(xì)胞刺激因子進(jìn)行了純化。此外，還采用反相HPLC對(duì)重組人胰島素進(jìn)行了純化，維持了活性結(jié)構(gòu)。純化實(shí)例圖47顯示了合成肽——促性腺激素釋放激素（GnRH）拮抗劑的純化過程。該純化過程通過以下幾個(gè)步驟展開：在4.6 x 250 mm 的分析柱上構(gòu)建洗脫條件。在50 x 300 mm 的柱上裝載1.2克合成肽混合物，基于diyi步構(gòu)建的條件洗脫（圖47）。對(duì) GnRH 拮抗劑各洗脫峰的片段進(jìn)行收集并借助分析法分析，Z終實(shí)現(xiàn)Z高產(chǎn)量和純度。用乙腈和TFA作為洗脫劑，在反相色譜柱上再次進(jìn)行色譜分析,完成收集到片段的脫鹽處理。收集片段實(shí)現(xiàn)Z高產(chǎn)量和純度。在該色譜純化步驟中，從1.2 gm的反應(yīng)混合液中可收集128 mg的純化肽。該純化過程采用了與分析色譜分離相同的有機(jī)溶劑——乙腈，但采用磷酸三乙胺替代了TFA。由于柱過載，洗脫峰更寬，分辨率不如分析色譜。但峰仍然較為緊密，且容易收集到含目的多肽和GnRH的洗脫液。圖47. 128mg的合成肽——促性腺激素釋放激素的純化。柱嚴(yán)重過載，導(dǎo)致峰非常寬。條件色譜柱：C18寬孔柱，15~20μm粒徑，50 x 300 mm。流動(dòng)相：乙腈和磷酸三乙胺水溶液梯度洗脫。樣品：促性腺激素釋放激素

2019-06-24 09:01:16蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南九: 二硫鍵測(cè)定蛋白質(zhì)依靠正確的二硫鍵鍵合維持其三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性。如果二硫鍵被還原或交換，則蛋白質(zhì)會(huì)失去天然三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性。 HPLC保留值取決于蛋白質(zhì)“疏水腳”的大小（圖41），它會(huì)受到三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。二硫鍵的改變通常會(huì)使“疏水腳”增大，從而使蛋白質(zhì)在反相HPLC中的保留值增大。圖42中，天然白細(xì)胞介素II的出峰遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于被還原的白細(xì)胞介素II，這是由于當(dāng)二硫鍵被還原時(shí)，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。圖41. 蛋白質(zhì)保留值取決于“疏水腳”的大小。被還原的二硫鍵會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生部分變性，這將增大“疏水腳”和反相保留值。圖42. 隨著二硫鍵的還原，白細(xì)胞介素II的“疏水腳”會(huì)增大，從而增加蛋白質(zhì)在反相HPLC上的保留值。條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：44.5%~50.8% 乙腈，以2 ml/min的流速進(jìn)行90分鐘的梯度洗脫樣品：白細(xì)胞介素II突變蛋白質(zhì)圖43. 對(duì)二硫鍵合正常和發(fā)生二硫鍵交換的類胰島素生長(zhǎng)因子的分離。條件色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：20~38% 乙腈：異丙醇（88:12）—0.1% TFA體系，梯度洗脫，27分鐘。即使是細(xì)微的二硫鍵改變也足以對(duì)疏水腳產(chǎn)生影響，從而改變保留值。天然類胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）的Cys52和Cys47以及Cys48和Cys6之間都有二硫鍵（圖43A紅色部分所示）。經(jīng)過36小時(shí)的空氣氧化，一些IGF蛋白分子內(nèi)出現(xiàn)了二硫鍵交換，變成了Cys52和Cys48以及Cys47和Cys6間的二硫鍵鍵合（圖43A藍(lán)色部分）。發(fā)生了二硫鍵交換的IGF比天然IGF出峰晚（圖43），表明了疏水腳的增大。天然蛋白的反相色譜法通常以反相保留值的變化揭示二硫鍵或蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。在蛋白酶水解蛋白過程中（通過省去DTT和羧甲基化過程），如果二硫鍵未被還原，則肽圖中仍會(huì)包含二硫鍵合的二肽。分別比較二硫鍵未還原和還原的肽圖能夠確定二硫鍵的位置。在二硫鍵還原和未還原條件下水解白細(xì)胞介素II，通過RP-HPLC法得到兩種水解產(chǎn)物的肽圖（圖44）。圖44A中，以T7+T10標(biāo)記出的肽是一種二硫鍵合的二肽。在二硫鍵被還原的條件下得到的肽圖顯示了兩種肽，分別為T7和T10（圖44B）。這證實(shí)了二硫鍵存在于這兩種肽之間。監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物肽能夠確定各個(gè)二硫鍵在蛋白質(zhì)中的位置。如果一個(gè)胰蛋白酶肽段內(nèi)存在兩個(gè)半胱氨酸，則必須利用另一種蛋白酶確定參與到二硫鍵中的半胱氨酸。通常將肽圖分析和質(zhì)譜法聯(lián)用確定二硫鍵的位置和狀態(tài)。圖44. 分別比較二硫鍵未還原（A圖）和還原（B圖）情況下白細(xì)胞介素II的肽圖。條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：5~80% 乙腈—0.1% TFA體系，混合梯度洗脫，99分鐘。樣品：A二硫鍵未還原情況下白細(xì)胞介素II的肽圖。B二硫鍵還原情況下白細(xì)胞介素II的肽圖。

2019-06-21 09:25:19蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南八: 脫酰胺作用 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南蛋白質(zhì)在高溫或高pH值下會(huì)降解。在脅迫條件下，Z有可能發(fā)生的化學(xué)降解是酰胺側(cè)鏈上的天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼峄虍愄於彼幔▓D37)。天冬酰胺脫去酰氨基時(shí)，許多蛋白都會(huì)失去生物活性，但也有部分蛋白的生物活性不受影響。即使脫酰胺作用不造成生物活性的減弱，脫酰胺作用也是蛋白接觸不利條件的指示。特定天冬酰胺殘基脫酰胺的可能性取決于其在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置。只有那些與溶劑接觸表面接近的天冬酰胺殘基才會(huì)發(fā)生脫酰胺作用。相鄰的氨基酸殘基同樣影響脫酰胺作用的可能性。與天冬酰胺相鄰的甘氨酸極大地增加了脫酰胺作用的可能性。與天冬酰胺相鄰的亮氨酸和異亮氨酸等大分子疏水性氨基酸降低了脫酰胺作用的可能性。由于脫酰胺作用會(huì)影響生物活性并能指示不利條件，因此慣常的做法是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)ZL藥物中天冬酰胺的脫酰胺作用。圖37. 當(dāng)酰胺側(cè)鏈暴露在高溫和/或高pH條件下時(shí)，天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。圖38. 人生長(zhǎng)激素脫酰胺作用的反相色譜分析條件色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：29% 異丙醇，71% 10 mM Tris鹽酸緩沖液、pH=7.5這通常由反相GX液相色譜法實(shí)現(xiàn)。圖38顯示了通過完整蛋白分子的反相色譜法測(cè)量人生長(zhǎng)激素的脫酰胺作用的一個(gè)試驗(yàn)。該試驗(yàn)pH為7.5，以使脫酰胺作用產(chǎn)生的天冬氨酸電離。這使得脫酰胺的生長(zhǎng)激素相較于天然蛋白疏水性減弱，從而比天然蛋白先洗脫出來。更常見的一種方法是通過肽圖中含天冬酰胺/天冬氨酸多肽的保留時(shí)間來測(cè)定脫酰胺作用。在pH為2的肽圖中，含有天冬氨酸的脫酰胺肽的疏水性比含天冬酰胺的天然肽略強(qiáng)，因此比天然肽略晚洗脫出來，如圖39所示。脫酰胺肽容易鑒別測(cè)定，為脫酰胺作用的判定提供了較好的方法。圖39. 部分脫酰胺的核糖核酸酶的肽圖條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：5%~38% 乙腈—0.1% TFA體系，混合梯度洗脫，100分鐘。有時(shí)，脫酰胺肽較難從天然肽中分離或會(huì)在肽圖中出現(xiàn)與其它肽的共洗脫峰。如果分辨率不足，則可以增加pH。如圖40所示，在低pH值下分離較差的脫酰胺肽能夠在6.5的高PH值下從天然肽中有效分離。在部分脫酰胺的人生長(zhǎng)激素的低pH肽圖中（圖40A），脫酰胺肽出峰稍晚于天然肽，但與肽圖中的另一種肽未分離。對(duì)肽峰進(jìn)行收集后以更高的pH（pH6.5）重新進(jìn)行色譜分離。在高pH值下，脫酰胺肽中的天冬氨酸被電離，出峰早于含天冬酰胺的天然肽，且峰形好（圖40B）。圖40. 部分脫酰胺的人生長(zhǎng)激素的肽圖中脫酰胺肽從天然肽的分離。A pH=2時(shí)，部分脫酰胺的hGH的肽圖（0.1% TFA）B 收集含天然肽（頂部）和脫酰胺肽（底部）的肽圖A中的肽段，在6.5的pH下重新進(jìn)行色譜分析。色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米A. 流動(dòng)相：乙腈-0.1% TFA體系梯度洗脫，pH 2.0B. 流動(dòng)相：乙腈-30 mM 磷酸鈉體系梯度洗脫，pH 6.5