標(biāo)準(zhǔn)曲線是啥？就是“王濛的眼睛”--尺子。標(biāo)準(zhǔn)曲線是ELISA實(shí)驗(yàn)的核心。有了它，我們的實(shí)驗(yàn)就不單單屬于二元研究了（是或不是），而是能夠研究更多的生物反應(yīng)細(xì)節(jié)，定量分析樣本的免疫活性。

標(biāo)準(zhǔn)品是繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)，那么該如何選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)品呢？標(biāo)準(zhǔn)品梯度又該如何設(shè)置呢？接下來，我們將會一一回答這些問題。

「ELISA問診室」將為大家解答標(biāo)準(zhǔn)品選擇相關(guān)的常見問題。

一、標(biāo)準(zhǔn)品首-選：重組蛋白

重組蛋白是絕大多數(shù)雙抗夾心法ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的首-選，而非天然蛋白。因?yàn)樘烊坏鞍自诖蠖鄶?shù)細(xì)胞和組織中表達(dá)量較小，難以大批量生產(chǎn)制備，并且天然蛋白存在于復(fù)雜的生物樣本中難純化。而重組蛋白恰恰相反。

重組蛋白與天然蛋白具有很高的相似度，主要與蛋白表達(dá)體系有關(guān)，比如真核表達(dá)系統(tǒng)中的哺乳動物細(xì)胞平臺，表達(dá)宿主有CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）和HEK293（人胚腎細(xì)胞），讓重組蛋白表達(dá)更真實(shí)，更接近天然蛋白樣本，具有更好的空間構(gòu)象和生物活性，且易于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，不同批次間質(zhì)量穩(wěn)定。

重組蛋白純度是ELISA標(biāo)準(zhǔn)品的關(guān)鍵指標(biāo)參數(shù)。純度通常通過SDS-PAGE或HPLC進(jìn)行檢測。高純度蛋白可以減少其他非靶點(diǎn)蛋白或雜質(zhì)的干擾信號。因此，選擇重組蛋白時(shí)純度越高越好（比如≥95%），但也需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的蛋白純度。

ELISA基于抗原抗體免疫反應(yīng)，需要標(biāo)準(zhǔn)品具有生物活性。ELISA 的EC50值常作為評估重組蛋白生物學(xué)活性的方法之一，EC50值越低，活性數(shù)據(jù)越好。同時(shí)內(nèi)毒素含量、批間穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等指標(biāo)也會影響ELISA標(biāo)準(zhǔn)品的性能。

二、標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋

標(biāo)準(zhǔn)品大多為重組蛋白的凍干粉，在使用前應(yīng)根據(jù)說明書將其復(fù)溶 按照說明書要求加入一定體積的指定稀釋液，上下顛倒混勻，或者振蕩器低轉(zhuǎn)速輕輕短暫震蕩混勻。待充分溶解后，靜置10-15分鐘，使重組蛋白恢復(fù)其空間構(gòu)象。室溫靜置還是冰上靜置，請按說明書操作或咨詢技術(shù)支持人員。然后進(jìn)行分裝凍存。

標(biāo)準(zhǔn)品工作液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，如有剩余請棄用。一般標(biāo)準(zhǔn)品工作液會有6-8個(gè)不同的濃度，常設(shè)置成倍比梯度，如1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、0 pg/mL。不同試劑盒或ELISA實(shí)驗(yàn)檢測靈敏度不同，標(biāo)準(zhǔn)品工作液的濃度會存在差異。工作液的體積也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體用量進(jìn)行調(diào)整，比如500μL、300μL、200μL。

標(biāo)準(zhǔn)品工作液制備基本相同，以1000pg/mL初始濃度、配制8個(gè)濃度梯度、各500μL工作液為例，可按照如下操作進(jìn)行：

1）準(zhǔn)備8個(gè)干凈的EP或離心管，并做好濃度標(biāo)識，如S1、S2……S7、Blank。

2）配制1mL 1000pg/mL的最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品S1，比如標(biāo)準(zhǔn)品儲存液濃度為50ng/mL，則用移液器吸取20μL儲存液，再加入980μL 1×標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，輕輕吹打10次混勻，或短暫渦旋震蕩混勻。置于冰上靜置。

3）在S2-S7管中依次加入500μL 1×標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。從S1中取500μL液體滴加到S2中，充分混勻后靜置1-2分鐘，然后從S2中取500μL液體滴加到S3中。按此操作依次吸取混勻。

4）在Blank管中加入500μL 1×標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為空白對照，不從S7中吸取液體。

原液建議復(fù)溶后分裝，-80℃凍存，長時(shí)間室溫放置要廢棄。標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋液若一次未使用完，同樣建議棄去。

關(guān)于ELISA標(biāo)準(zhǔn)品選擇和使用，您還有哪些建議或經(jīng)驗(yàn)?zāi)兀?/p>

歡迎大家在評論區(qū)留言，分享你的心得體會。?歡迎關(guān)注義翹神州官網(wǎng)（cn.sinobiological.com）或添加V信“sinobio2023"進(jìn)行聯(lián)系！