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抗生素效價測定教學片
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抗生素效價測定教學片
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2012-09-14 00:00
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ELISA技術測定單克隆抗體效價方法
- 1.深入了解ELISA法測定抗體效價的原理?! ?.掌握ELISA法測定單克隆抗體效價的方法。 二、實驗原理 ELISA是以免疫學反應為基礎,將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的GX催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。免疫酶技術是將酶標記在抗體/抗原分子上,形成酶標抗體/酶標抗原,稱為酶結合物。該酶結合物的酶在免疫反應后,作用于底物使之呈色,根據(jù)顏色的有無和深淺,定位或定量抗原/抗體。ELISA試劑盒是免疫酶技術的一種,其特點是利用聚苯乙烯微量反應板(或球)吸附抗原/抗體,使之固相化,免疫反應和酶促反應都在其中進行。在每次反應后都要反復洗滌,這既保證了反應的定量關系,也避免了末反應的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA法中.酶促反應只進行一次,而抗原、抗體的免疫反應可進行一次或數(shù)次,即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進行免疫反應。 目前常用的幾種ELISA方法有:測定抗體的間接法,測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價。其主要過程為:首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應板的凹孔內,加待測抗體,保溫后洗滌以除去未結合的雜蛋白質,加酶標抗抗體,保溫后洗滌,加底物保溫30分鐘后,加酸或堿終止酶促反應,用目測或光電比色測定抗體含量。 三、儀器、原料和試劑 儀器 聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。 原料 單克隆抗體 試劑 1.抗原及酶標記抗體 ?、倏乖和每谷薎gG(RabbitAanti-humanIgG,CodeNo.A0423); ?、诿笜丝箍贵w:兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP,CodeNo.P0260);均為 DAKO公司產品,使用時按照說明書要求稀釋?! ?.洗滌液(含0.05%Tween20的PBS):1LPBS中加入Tween-20500μL?! ?.ELISA試劑盒封閉液(含1%牛血清白蛋白,0.1%Tween20的PBS):10mLPBS中加入100mgBSA,10μLTween-20。6.底物溶液 ①磷酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0):稱Na2HPO412H2O2.2g,NaH2PO42H2O6.84g,用蒸餾水溶解,定容至500mL?! 、赥MB貯液:稱60mgTMB溶于10mL二甲基亞砜中,4℃避光保存?! 、鄣孜飸靡海含F(xiàn)用現(xiàn)配,磷酸鈉緩沖液10mL,TNB貯液10μL。30%H2O215μL,混勻?! ?.終止液:2mol/LH2SO4 四、操作步驟 ①抗原包被:兔抗人IgG作為抗原,用包被液l:8000稀釋,100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板 中。4℃放置?! 、谙礈欤捍稳諆A去凹孔內的液體,洗滌液洗3次?! 、鄯忾]:加l00μL/孔封閉液,室溫放置0.5h?! 、芟礈欤河孟礈煲合?次。 ?、菁哟郎y樣品(一抗):將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清在另塊板上用PBS連續(xù)稀釋(按照1:2或1:10),100μL/孔加到已包被的板上,每個樣品平行做兩份,PBS或空白培養(yǎng)基作為陰性對照,已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h?! 、尴礈欤河孟礈煲合?次。 ?、呒用笜丝箍贵w:兔抗鼠IgG-HRP,用封閉液l:8000稀釋,100μL/孔,加蓋37℃恒溫箱溫育1h?! 、嘞礈欤河孟礈煲合?次,蒸餾水洗2次?! 、犸@色:ELISA試劑盒加新鮮配制的底物溶液100μL/孔,室溫暗處放置5~30min,顯示藍色?!、饨K止反應、比色:加50μL/孔終止液.顏色變黃;用酶標儀測定450nm處各孔的吸光值,陽性反應的Zda稀釋度為待測樣品的效價。[詳細]
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