透射電鏡是一種綜合性大型分析儀器，在現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的研究開發(fā)工作中被廣泛地使用。透射電鏡工作原理是以電子束透過樣品經(jīng)過聚焦與放大后所產(chǎn)生的物像，投射到熒光屏上或照相底片上進(jìn)行觀察。

透射電鏡樣品制備要求

　　透射電鏡樣品制備基本要求：①盡可能保持材料的結(jié)構(gòu)和某些化學(xué)成分生活時(shí)的狀態(tài);②材料的厚度一般不宜超過1000埃。組織和細(xì)胞，必須制成薄切片以獲得較好的分辨率和足夠的反差;③采用各種手段，如電子染色、投影、負(fù)染色等來提高生物樣品散射電子的能力，以獲得反差較好的圖像。

　　透射電鏡樣品制備的方法隨生物材料的類型以及研究目的而各有不同。對(duì)生物組織和細(xì)胞等，一般多用超薄切片技術(shù)，將大尺寸材料制成適當(dāng)大小的超薄切片，并且利用電子染色、細(xì)胞化學(xué)、免疫標(biāo)記及放射自顯影等方法顯示各種超微結(jié)構(gòu)、各種化學(xué)物質(zhì)的部位及其變化。對(duì)生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸)、細(xì)菌、病毒和分離的細(xì)胞器等顆粒材料，常用投影、負(fù)染色等技術(shù)以提高反差，顯示顆粒的形態(tài)和微細(xì)結(jié)構(gòu)。此外還有以冷凍固定為基礎(chǔ)的冷凍斷裂、冰凍蝕刻、冷凍置換、冷凍干燥等技術(shù)。

超薄切片技術(shù)

　　將小塊生物材料，用液態(tài)樹脂單體浸透和包埋，并固化成塑料塊，后用超薄切片機(jī)切成厚度為500埃左右，甚至只有50埃的超薄切片。超薄切片的制備程序與光學(xué)顯微鏡的切片程序類似，但各步驟的要求以及所使用的試劑和操作方法有很大差別。

固定技術(shù)

　　選用適宜的物理或化學(xué)的方法迅速殺死組織和細(xì)胞，力求保持組織和細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)，并使其中各種物質(zhì)的變化盡可能減小。固定能提高細(xì)胞承受包埋、切片、染色以及透射電鏡電子束轟擊的能力。主要固定方法有：

　?、倏焖倮鋬?，用致冷劑(如液氮、液體氟利昂、液體丙烷等)或其他方法使生物材料急劇冷凍，使組織和細(xì)胞中的水只能凍結(jié)成體積極小的冰晶甚至無定形的冰玻璃態(tài)。這樣，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不致被冰晶破壞，生物大分子可保持天然構(gòu)型，酶及抗原等能保存其生物活性，可溶性化學(xué)成分(如小分子有機(jī)物和無機(jī)離子)也不致流失或移位。用冷凍的組織塊，可進(jìn)行切片、冷凍斷裂、冷凍干燥和冷凍置換等處理。用此法固定的樣品既可提供組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)信息，又可提供相關(guān)的細(xì)胞化學(xué)信息。

　?、诨瘜W(xué)固定，固定劑有凝聚型和非凝聚型兩種，前者如光學(xué)顯微術(shù)中常用的乙醇、二氯 化汞等，此法常使大多數(shù)蛋白質(zhì)凝聚成固體，結(jié)構(gòu)發(fā)生重大變化，常導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)畸變。非凝聚型固定劑包括戊二醛、丙烯 醛和甲醛等醛類固定劑和四氧 化鋨，四氧化鉬等，適用于電子顯微。它們對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的交聯(lián)作用，可以穩(wěn)定大部分蛋白質(zhì)而不使之凝聚，避免了過分的結(jié)構(gòu)畸變。它們與細(xì)胞蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的化學(xué)親和力，固定處理后，固定劑成為被固定的蛋白質(zhì)的一部分。如用含有重金屬元素的固定劑四氧 化鋨(也是良好的電子染色劑)進(jìn)行固定，因?yàn)殇~與蛋白質(zhì)結(jié)合，增強(qiáng)了散射電子的能力，提高了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的反差。

　　固定操作方法通常是先將材料切成1立方毫米左右小塊，浸在固定液中，保持一定溫度(通常為4℃)，進(jìn)行一定時(shí)間的固定反應(yīng)。取材操作要以盡可能快的速度進(jìn)行，以減少組織自溶作用造成的結(jié)構(gòu)破壞。對(duì)某些難以固定的特殊組織，如腦、脊髓等，Z好使用血管灌注方法固定，即通過血管向組織內(nèi)灌注固定液，使固定液在組織發(fā)生缺氧癥或解剖造成損傷之前，快速而均勻地滲透到組織的所有部分。灌注固定的效果比浸沒固定好得多。

脫水技術(shù)

　　化學(xué)固定后，將材料浸于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑中以除去組織的游離水。為避免組織收縮，所用溶劑需從低濃度逐步提高到純有機(jī)溶劑，逐級(jí)脫水。

浸透技術(shù)

　　脫水之后，用適當(dāng)?shù)臉渲瑔误w與硬化劑的混合物即包埋劑，逐步替換組織塊中的脫水劑，直至樹脂均勻地浸透到細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一切空隙中。

包埋技術(shù)

　　浸透之后，將組織塊放于模具中，注入樹脂單體與硬化劑等混合物，通過加熱等方法使樹脂聚合成堅(jiān)硬的固體。用作包埋劑的樹脂有甲基丙烯酸酯、聚酯和環(huán)氧樹脂等。Z廣泛使用的是某些類型的環(huán)氧樹脂，如618樹脂、Epon812、Araldite和Spurr等商品樹脂。它們具有良好的維持樣品特性、低收縮率和較強(qiáng)的耐電子轟擊能力等優(yōu)點(diǎn)。

切片技術(shù)

　　制備超薄切片要使用特制超薄切片機(jī)(大多是根據(jù)精密機(jī)械推進(jìn)或金屬熱膨脹推進(jìn)原理制成)和特殊的切片刀(用斷裂的玻璃板制成的玻璃刀或用天然金剛石研磨而成的金剛石刀)。先將樹脂包埋塊中含有生物材料的部分，用刀片在立體顯微鏡下修整成細(xì)小的金字塔形，再用超薄切片機(jī)切成厚度適中(500埃左右)的超薄片，切片應(yīng)依次相互聯(lián)接形成切片帶。切片帶漂浮于裝在切片機(jī)上的水槽中的水面上。

　　通過裝置在切片機(jī)上的解剖顯微鏡，監(jiān)控切片過程。用熒光燈照射水面上的切片，并根據(jù)由此產(chǎn)生的干涉光顏色來判斷切片的實(shí)際厚度。

　　切片通常用敷有薄的支持膜的特制金屬載網(wǎng)，從水面上撈取?？焖倮鋬龉潭ǖ纳锊牧希捎美鋬龀∏衅b置制成切片。用醛類或冷凍方法固定的組織，可通過超薄切片術(shù)與生物化學(xué)技術(shù)、免疫技術(shù)等結(jié)合使用，進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)水平上的蛋白質(zhì)、核酸、酶及抗原等生物活性物質(zhì)的定位甚至定量研究。這就是透射電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和透射電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。

染色技術(shù)

　　透射電鏡主要是依賴散射電子成像，為了增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的電子反差，需要對(duì)切片進(jìn)行染色。染色是依據(jù)各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)與染色劑(重金屬鹽)結(jié)合的選擇性，而形成不同的對(duì)電子散射能力，從而產(chǎn)生借以區(qū)別各種結(jié)構(gòu)的反差。

　　電子染色方法分塊染色和切片染色兩種：①塊染色法，在脫水劑中加入染色劑，在脫水過程中對(duì)組織塊進(jìn)行電子染色。②切片染色法，即將透射電鏡載有切片的金屬載網(wǎng)漂浮或浸沒在染色液中染色。也可使用有微處理機(jī)控制的染色機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化染色。一般切片染色所使用的染色劑為金屬鈾鹽和鉛鹽的雙重染色。為顯示某種特殊結(jié)構(gòu)，則可采用與該結(jié)構(gòu)有特異性結(jié)合的選擇性染色劑。

冷凍置換技術(shù)

　　用有機(jī)溶劑(如丙酮、乙 醚等)在低溫條件下(通常，-80～-90℃)，緩慢地置換冷凍固定的小塊組織中的冰(“惰性脫水”)，這樣可減少常規(guī)方法脫水過程中有機(jī)溶劑對(duì)組織中化學(xué)組分的抽取。然后再按常規(guī)方法進(jìn)行樹脂包埋、超薄切片和染色等。用冷凍置換法，可以很好地保存快速變化過程中物質(zhì)的狀態(tài)和非常脆弱的超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)某些化學(xué)組分。

透射電鏡放射自顯影技術(shù)

　　用超薄切片術(shù)與放射性同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的透射電鏡放射自顯影術(shù)(見同位素技術(shù))可獲得同位素標(biāo)記的化合物在組織細(xì)胞內(nèi)存在部位，以及在代謝過程中物質(zhì)的合成、分解、轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌的信息。

負(fù)染色技術(shù)

　　研究以蛋白質(zhì)為主要成分的顆粒狀材料的Z常用方法。以某些在電子束轟擊下穩(wěn)定而又不與蛋白質(zhì)相結(jié)合的重金屬鹽類作為負(fù)染色劑，使之在支持膜上將顆粒材料包圍，形成具有高電子散射能力的背景，襯托出低電子散射能力的顆粒的形態(tài)細(xì)節(jié)。其所成的電子顯微像的反差與常規(guī)電子染色相反，即暗的背景和亮的顆粒形態(tài)的所謂陰性反差。負(fù)染色方法簡便，所獲得的顆粒的電子顯微圖像反差強(qiáng)，分辨率也高于超薄切片，可廣泛用于透射電鏡研究蛋白質(zhì)分子、細(xì)菌鞭毛、蛋白質(zhì)結(jié)晶，以及生物膜及分離的細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，特別適用于蛋白質(zhì)大分子及病毒顆粒結(jié)構(gòu)的三維重建研究。

　　用液滴法或噴霧法將顆粒材料的懸液加在載網(wǎng)的支持膜上，然后滴加負(fù)染色劑溶液?；?qū)㈩w粒的懸液與負(fù)染色劑按一定濃度混合滴加或噴撒到支持膜上，吸去多余液體，待干燥后，即可用透射電鏡觀察。樣品顆粒在支持膜上的均勻分散是成功的關(guān)鍵之一。染色劑溶液的pH則是成功的另一關(guān)鍵。一般染色劑的pH應(yīng)在中性偏酸范圍(pH5～7)，但對(duì)不同種類的顆粒材料和染色劑，Z適pH也不盡相同。

　　投影在真空蒸發(fā)器的高真空腔中，加熱某些金屬至熔化后，金屬以細(xì)小顆粒沿直線方向蒸發(fā)出來。當(dāng)金屬微粒以一定入射角噴鍍?cè)谳d有顆粒材料的載網(wǎng)支持膜表面上時(shí)，顆粒向蒸發(fā)源的一面即被鍍上一層金屬薄膜，而背蒸發(fā)源的一面及附近區(qū)域形成無金屬沉積的“陰影”，并且由于各部位散射電子能力存在著差別，這樣就能構(gòu)成具有強(qiáng)烈反差和立體感的電子顯微圖像。常用于投影的蒸發(fā)材料，有金、鉻、鉑、鈀以及鉑-銥、鉑-鈀、鉑-碳等金屬或合金。此外，還可利用電子槍投影裝置使鎢、鉭等高熔點(diǎn)金屬以極微細(xì)顆粒蒸發(fā)，從而獲得高分辨率投影。

蛋白質(zhì)展膜技術(shù)

　　用透射電鏡研究核酸分子常用的方法。某些堿性球蛋白，如細(xì)胞色素c，可以在低濃度鹽溶液或蒸餾水表面展成單分子層，在展開過程中，能為蛋白質(zhì)的堿性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)所吸附的、帶負(fù)電荷的核酸分子同時(shí)展開成完整的線狀分子。然后，用帶有支持膜(有機(jī)膜或碳膜)的載網(wǎng)撈起這些蛋白質(zhì)核酸展膜，并用染色或金屬投影法提高核酸分子的反差，可在透射電鏡下直接觀察核酸分子的形態(tài)、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，并可通過分子長度的測量來計(jì)算核酸分子量。

冷凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù)

　　研究細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，特別是生物膜結(jié)構(gòu)的一種獨(dú)特的樣品制備技術(shù)。利用快速冷凍方法固定的生物組織塊具有剛性和脆性。在對(duì)其施加外力后，組織即在結(jié)構(gòu)上結(jié)合Z薄弱的部位發(fā)生“脆性斷裂”，這就是“冷凍斷裂”。

　　對(duì)于生物膜，斷裂沿膜內(nèi)部疏水區(qū)發(fā)生，從而暴露出膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)。利用投影和復(fù)型技術(shù)，制備斷裂面的復(fù)型，然后將組織腐蝕掉，并用載網(wǎng)撈起復(fù)型膜，就可用透射電鏡來研究組織斷裂表面所顯示的細(xì)胞的或生物膜內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)。在高于10^-5毫米汞柱真空度和-100℃溫度下，冷凍組織的斷裂表面上的冰升華為水蒸汽，而使原表面高度下降，即謂之“冰凍蝕刻”。由于組織各部分結(jié)構(gòu)的含水量不同，冰的升華造成各部分結(jié)構(gòu)的表面高度下降程度有差異，因此冰凍蝕刻的斷裂表面的投影、復(fù)型所顯示的斷裂表面形態(tài)具有很強(qiáng)的立體感。

　　冷凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù)，為細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，特別是關(guān)于細(xì)胞聯(lián)接、細(xì)胞融合、細(xì)胞分化以及生物膜的通透性的研究提供了許多重要信息。也為流行的生物膜結(jié)構(gòu)模型，即“流動(dòng)鑲嵌模型”的研究提供了有利的證據(jù)。