治 療性寡核苷酸是由固相化學(xué)合成工藝生產(chǎn)。在合成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)包含許多目標(biāo)產(chǎn)物的類(lèi)似物（分子量的差別：堿基數(shù)N-1、N、N+1等），磷酸基S化等的不對(duì)稱(chēng)化合物、異構(gòu)體等。因此，雜質(zhì)的分析監(jiān)控對(duì)工藝和質(zhì)量控制就顯得十分重要。

液相色譜技術(shù)具有樣品適用范圍廣、分離效率高、速度快等特點(diǎn)，已成為核酸藥物生產(chǎn)與質(zhì)控分析必不可少的重要手段。本期內(nèi)容將介紹TSKgel色譜柱在寡核苷酸分析中的選擇與應(yīng)用。

01寡核苷酸的HPLC分離模式

下表中列舉了寡核苷酸HPLC分析的幾種分離模式及適用的分離條件。也可以通過(guò)連用MS進(jìn)行檢測(cè)。

02寡核苷酸的純度檢驗(yàn)

在離子交換色譜柱中，可以對(duì)離子基團(tuán)與主成分有一處不同的化合物進(jìn)行分離，比如能夠分離n-1、n、n+1的化合物。下圖是TSKgel DNA-NPR陽(yáng)離子交換色譜柱對(duì)13個(gè)堿基的硫代磷酸寡核苷酸粗樣分析的色譜圖。

下圖是TSKgel DNA-STAT色譜柱對(duì)粗制的寡核苷酸與純化后的樣品進(jìn)行純度評(píng)估。

03不同堿基數(shù)寡核苷酸的分析

在寡核苷酸的分析中，尺寸排阻分離模式是基于堿基數(shù)量、磷酸基不同導(dǎo)致的分子量差別進(jìn)行分離，通常用于簡(jiǎn)單的質(zhì)量控制或純度研究。該模式的優(yōu)點(diǎn)是可以使用接近生理?xiàng)l件的洗脫溶液進(jìn)行等度分離。有時(shí)也會(huì)添加水溶性有機(jī)溶劑來(lái)抑 制疏水吸附。

下圖是采用兩根串聯(lián)的SEC色譜柱TSKgel UP-SW2000來(lái)區(qū)分長(zhǎng)度相差一個(gè)堿基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。

04脂質(zhì)體包被的siRNA的SEC分離

下圖是使用TSKgel SuperSW2000色譜柱對(duì)天然型DNA核酸藥物Defitelio進(jìn)行質(zhì)量分析的示例。

參考文獻(xiàn)：Handbook of analysis of oligonucleotides and related Products, Feb.23 (2011) 125, Edited by J.V. Bonilla et al.

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