眾所周知，蛋白質(zhì)通常容易由于環(huán)境條件刺激而發(fā)生聚集，形成二聚體和大分子量低聚物或高階結(jié)構(gòu)。這在生物治 療蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中尤為重要，因為目標(biāo)蛋白質(zhì)需要承受的多種環(huán)境條件都可能誘導(dǎo)聚集。這些條件包括發(fā)酵過程中溫度和濃度的變化，以及下游處理過程中 pH 和濃度的變化。甚至剪切力（來自葉輪葉片、攪拌器和其他工程設(shè)備）也可能導(dǎo)致應(yīng)激相關(guān)聚集。聚集體，特別是分子量非常大的多聚體以至不溶性微粒的存在，都可能會對健康有害。因此，必須量化和確定聚集水平，并予以限制。

體積排阻色譜是特別適合從高階聚集體中分離單體峰的技術(shù)之一。使用合適的濃度檢測器，例如 UV 或 DAD，可以相對直觀地進行定量?？贵w藥物偶聯(lián)物（ADC）等更為復(fù)雜的分子可能更具挑戰(zhàn)性，因為疏水性細(xì)胞毒性藥物的存在可能導(dǎo)致許多體積排阻色譜柱無法發(fā)揮理想性能。為解決這一問題，安捷倫開發(fā)了一種新的固定相，可顯著降低次級相互作用的風(fēng)險。因此，新型 AdvanceBio SEC 色譜柱非常適合聚合物的快速分離和定量。

本應(yīng)用文集分別從入門指南篇、體積排阻色譜操作指南篇、精選應(yīng)用簡報篇分類介紹創(chuàng)新的 AdvanceBio SEC 色譜柱如何精 準(zhǔn)定量分析蛋白質(zhì)聚集體研究的完整工作流程及應(yīng)用案例，進而“柱”力提高生物藥行業(yè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性。準(zhǔn)備好了嗎？系好您的安全帶，立刻啟航！

體積排阻色譜操作指南篇

適合各種生物分子分離的準(zhǔn)確定量分析

利用生物分子在溶液中的體積而進行色譜分離的方法即為體積排阻色譜 (SEC)。與其他色譜模式不同，SEC 的分離不依靠分析物和色譜柱固定相之間的任何化學(xué)作用。這是從多種干擾物（包括聚集體、輔料、細(xì)胞碎片及其他降解產(chǎn)生的雜質(zhì)）中分離和分析完整蛋白質(zhì)的理想解決方案。因此，SEC 廣泛應(yīng)用于開發(fā)和生產(chǎn)過程中的生物治 療性分子表征。

 優(yōu)勢如下   

SEC 分析方法簡單直接   

利用 SEC，分子可按其在溶液中的尺寸為參照，做到從大到小依次分離。非常大的分子不會進入填充柱床，會在死體積內(nèi)Z先洗脫。大小適中的分子依據(jù)其體積的不同可以不同程度地滲透進微孔中（圖 1），而Z小的分子在微孔結(jié)構(gòu)中擴散Z深，從而Z后洗脫。

圖 1. 不同體積的分子以不同程度滲入固定相孔隙內(nèi)

體積排阻色譜法適用于分離和定量蛋白質(zhì)混合物，因此是重組蛋白生產(chǎn)過程中的一種重要質(zhì)控手段。包括測定聚集體（二聚體、三聚體、四聚體等）以及從較大分子量的蛋白質(zhì)中分離低分子量的輔料和雜質(zhì)（圖 2）。

圖 2. IgG 聚集體和輔料的分離

 完整 lgG 單體和二聚體的分離條件   

洗脫順序通常由分子量大小決定，分子量Z 大的分子Z先被洗脫，但 SEC 真正的分離機制是基于分子在溶液中的體積。大多數(shù)蛋白是緊湊型球形結(jié)構(gòu)，但一些蛋白分子是圓柱形，因此可能會比預(yù)期洗脫更早，這是由于它們在溶液中有著更大的流體動力學(xué)半徑（圖 3）。此外，不同的流動相也會影響洗脫順序，因為溶液中分子體積會改變（流體動力學(xué)半徑或回轉(zhuǎn)半徑）。

圖 3. 緊湊型球狀蛋白與圓柱形蛋白的對比

 SEC-UV/DAD 方法開發(fā)指南   

針對生物分子、聚集體分析（肽、多肽和蛋白質(zhì)）的基于體積的分離選擇初始色譜柱和條件。

精彩亮相

安捷倫提供各種 SEC 色譜柱，可滿足您的所有體積排阻分析需求。

此外，本篇應(yīng)用文集中還包含 AdvanceBio SEC、Bio SEC-3 及標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)助方法開發(fā)等簡報，可供官網(wǎng)查閱，為生物治 療蛋白質(zhì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性提供新方法，新思路。

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