引言

耳石（脊椎動物內(nèi)耳）的顯微組織分析對于研究魚的生長模式和年齡是一個重要的工具。這一信息可進一步用于總的魚群、物種動態(tài)特性、以及了解環(huán)境變化的影響等更大范圍的研究。 

魚的年齡通常是通過檢查和計數(shù)鱗片上的生長環(huán)或是在耳石（內(nèi)耳的小骨）上看到的環(huán)狀組織來確定的。這些環(huán)對應于環(huán)境的季節(jié)變化并可以與樹干的年輪相比較。如果這些環(huán)生長迅速，它們的間隔就比較寬；當環(huán)與環(huán)之間的間隔比較窄時，就表明生長比較緩慢。

耳石共有三對，Z常分別稱為耳沙（內(nèi)耳囊狀物部分的一種石狀物）、扁平石（多數(shù)魚的兩個耳石中較大的一個）、和星狀耳石。它們的所在位置、功能、尺寸、形狀、以及超微結(jié)構(gòu)方面均不相同。這些差異會影響到制備方案的確定，例如拋光面以及所必需的制備量。

尺寸具有特殊的重要性，因為較大耳石具一般有較大的三維深度和不規(guī)則性，從而限制了顯微組織的外觀觀察。另一方面，對于較小的耳石，有可能不經(jīng)切割或拋光就可以觀察其顯微組織。

大多數(shù)情況下，需將耳石清潔而準確地切割成非常薄的截面。這樣就可以看到環(huán)狀組織。對于厚度大于100μm的耳石，將試樣拋光可能會更好些。這樣做在觀察環(huán)狀組織時將使分辨率得到改善。

為了能繼續(xù)增進對魚群動態(tài)特性的了解，很好地確定耳石的分離、制備、和分析技術(shù)并適當側(cè)重質(zhì)量控制十分重要。許多情況下，研究者已經(jīng)擬訂出針對某一物種的特定方法。這里所介紹的方法還是屬于相當一般性的。

制備步驟

1.記錄魚標本的數(shù)據(jù)。然后將耳石與魚分離。在漂白劑中適當?shù)厍逑床⒂谜麴s水沖洗。用酒精溶液去除任何殘留的水分，然后對所選的耳石進行稱重和測量。

2.對試樣選擇適當?shù)蔫偳督橘|(zhì)。對于經(jīng)過橫向切割后仍保持完整的試樣，通常選用石蠟作為鑲嵌介質(zhì)。如果截面還將進行拋光，建議采用具有低粘度的硬介質(zhì)，例如EpoHeat?加熱固化環(huán)氧樹脂。

3. 準備一個模具并涂敷脫模劑以便使試樣容易脫模。根據(jù)制造商的指示將鑲嵌介質(zhì)進行混合。澆入模具至一半高度，然后等候環(huán)氧樹脂固化。

4. 將耳石放入半填滿的模具中。用一滴氰基丙烯酸脂膠在一定取向位置將耳石粘附于已固化的環(huán)氧樹脂。這樣做可以在剩余的環(huán)氧樹脂澆入模具時，試樣不會移位。

5. ZH將鑲嵌介質(zhì)澆入模具，使其完全覆蓋耳石。然后等候環(huán)氧樹脂固化。

6. 用 IsoMet^? 型精密切割機并使用15LC 型切割片將耳石周圍多余的鑲嵌介質(zhì)切除。由于能減少在磨光過程中需要除去的環(huán)氧樹脂表面面積，因此能省去制備時間。平行切一刀將能保證建立正確的拋光面。切割片的選擇能影響ZZ結(jié)果的質(zhì)量。以鈣為基礎(chǔ)的耳石相當軟，用常規(guī)的砂輪片就可以進行切割。然而，金剛石切割片的剛性卻可提供更多的控制，一般能產(chǎn)生更直的切割。

7. 用Crystalbond鑲嵌石蠟將鑲嵌好的耳石粘附在玻璃載片上。您需要將熱板預熱到膠的軟化溫度以上(85-100 °C)。調(diào)整好鑲嵌試樣在玻璃載片上的取向，使需要Z初進行拋光的表面朝上并平行于感興趣的平面。

8. 用一系列CarbiMet^? 型碳化硅砂紙進行磨光，從240粒度(P280)直到1200粒度(P2500)。握住載片使其平行于磨光表面，對表面施以均勻的壓力。當磨光進入耳石后，要經(jīng)常用光學顯微鏡檢查截面。要檢查芯部的出現(xiàn)和位置。ZX部位是一個圓形區(qū)域，其周圍有一些反差相對較高的同心環(huán)，其直徑約小于20μm。當您接近芯部時，換用粒度較細的砂紙。

9. 一旦達到ZX部位，用MicroPolish^? 系列粒度為0.3微米不會團聚的氧化鋁磨料將試樣表面在MicroCloth^? 型拋光織物上進行拋光。

10. 清洗并觀察耳石的表面。單面制備有可能使環(huán)狀組織有足夠的分辨率。然而，對于較大的耳石，需將雙面進行拋光才能獲得更高的分辨率。

11. 將玻璃載片再次放在熱板上，使Crystalbond石蠟正好能夠軟化。將玻璃載片從拋光好的耳石鑲嵌試樣移開。在玻璃載片上再添加一些石蠟，并將一小片玻璃放在石蠟上。在這片玻璃上再添加一些石蠟以固定住鑲嵌試樣。增添一片玻璃是為了增加制備過程的工作距離。這樣做可以使得在玻璃載片之上更容易握住試樣，因為試樣截面已經(jīng)變得更薄了。另一個變通辦法就是在MiniMet^? 1000型磨光-拋光機上使用一個薄截面夾持器（商品編號69-1583）。將制備過程自動化可以接省時間。用手進行磨光還可以集中磨薄截面的某一面或另一面，ZZ使某一面更薄一些。

12. 將玻璃載片從熱板拿開并將拋光表面放在玻璃片上。施加壓力，避免在鑲嵌試樣和玻璃片之間形成氣泡。

13. 和以前一樣進行拋光，密切監(jiān)控進程直到截面厚度達到10至50μm。目測觀察芯部及增長環(huán)是否具有足夠的反差。用MicroPolish^? II 型拋光懸浮液在MicroCloth^? 型拋光織物上進行ZZ拋光。

注：耳石的形貌與魚的物種和年齡有關(guān)。在有些情況下，可能會出現(xiàn)更復雜的形貌。例如，耳石的生長軸會處于幾個相交的平面上。其后果是，單獨一個平面不能包含芯部和所有的增長環(huán)。為了得到完整的紀錄，需要交替進行拋光并將顯微組織進行拍攝。然后進行疊化以觀察到完整的顯微組織。盡管觀察的復雜性以及多個觀察面，制備過程本身基本相同。

設(shè)備*

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IsoMet^?系列線性精密切割機

MiniMet^? 1000型磨光-拋光機

消耗器材*

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IsoMet^?金剛石薄切割片

EpoHeat?

脫模劑

Crystalbond鑲嵌石蠟

CarbiMet^?碳化硅砂紙

MicroPolish^? II型、粒度為0.3μm不會團聚的氧化鋁懸浮液

MicroCloth^? 型拋光織物