前言

在單抗的發(fā)酵、純化和存儲(chǔ)過程中，因?yàn)槊富蛘叻敲傅臈l件，導(dǎo)致單抗存在一系列翻譯后修飾，例如單抗類制品的脫酰胺化、N端焦谷氨酸基團(tuán)修飾、異構(gòu)化、唾液酸化聚糖和C端賴氨酸裁剪等蛋白質(zhì)修飾作用都會(huì)導(dǎo)致電荷變異體的形成，而某些電荷變異體由于對(duì)單抗穩(wěn)定性及其生物學(xué)功能發(fā)揮具有重要的影響而成為關(guān)鍵質(zhì)量屬性( CQA) ，在藥品穩(wěn)定性研究、上市申報(bào)及批放行檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)都需要進(jìn)行研究或檢測(cè)，因此對(duì)治 療性單抗進(jìn)行電荷變異體分析和控制十分必要。又如，輕鏈N30的脫酰胺造成赫賽汀輕微的效價(jià)丟失，重鏈N55的脫酰胺造成該藥物效價(jià)的顯著降低。在這些翻譯后修飾中，很多會(huì)導(dǎo)致抗體電荷的變化，即形成電荷異構(gòu)體。

傳統(tǒng)的的電荷異構(gòu)體分離方法包括離子交換和電泳法。兩種方法分離機(jī)理不同，離子交換法根據(jù)抗體表面電荷的不同使用鹽梯度或pH梯度進(jìn)行分離，而電泳法根據(jù)抗體凈電荷的不同進(jìn)行分離，包括平板膠電泳（IEF）、毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF）、自由流電泳（FFE）、成像毛細(xì)管等電聚焦電泳（iCIEF）等，其中iCIEF法已收錄進(jìn)入2020版中國(guó)藥典（通則3129）用于等電點(diǎn)及電荷變異體含量測(cè)定。對(duì)于抗體酸堿異構(gòu)體的充分表征，有利于對(duì)所開發(fā)抗體進(jìn)行更深入的了解，進(jìn)而指導(dǎo)生產(chǎn)工藝、純化工藝的進(jìn)一步優(yōu)化。從NDA申報(bào)的角度，也必須對(duì)單抗電荷變異體進(jìn)行充分研究。

因此，隨著抗體行業(yè)的不斷優(yōu)化，對(duì)酸堿變異體的定性分析需求日益增長(zhǎng)。常規(guī)的離子交換法和iCIEF法都用UV作為檢測(cè)器。但UV檢測(cè)器僅依靠保留時(shí)間定性，無(wú)法對(duì)沒有對(duì)照品的組分進(jìn)行歸屬。由于常規(guī)離子交換法和iCIEF方法使用難揮發(fā)性的鹽作為流動(dòng)相或者添加劑，造成這兩種方法難以與定性Z 為強(qiáng)大的檢測(cè)器-MS兼容。如離子交換法用氯化鈉和磷酸鹽作為流動(dòng)相添加劑，iCIEF方法使用甲基纖維素和尿素作為添加劑。發(fā)展MS兼容的電荷異構(gòu)體分離方法對(duì)抗體行業(yè)的生產(chǎn)技術(shù)優(yōu)化和抗體質(zhì)量研究有著重要的意義，因此近年來(lái)，各研究結(jié)構(gòu)和研究人員開始關(guān)注該領(lǐng)域。

中國(guó)食品藥品檢定研究院（NIFDC）研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表了iCIEF與高分辨質(zhì)譜在線聯(lián)用（iCIEF-HRMS），以及IEX與高分辨質(zhì)譜的在線聯(lián)用（SCX-HRMS）的對(duì)比工作（原文參考鏈接見文末）。作者對(duì)這兩種技術(shù)的分離度、靈敏度、柱上殘留和定性準(zhǔn)確性上進(jìn)行了系統(tǒng)對(duì)比。隨后，作者將iCIEF-HRMS技術(shù)用于了9種等電點(diǎn)不同的單抗的電荷異構(gòu)體分析。對(duì)于iCIEF常見的柱壽命和柱批次重復(fù)性問題也做了考察和說(shuō)明。

實(shí)驗(yàn)材料及方法

表1展示了本文中使用的九種mAb等電點(diǎn)及iCIEF分析溶液體系配比，SCX-MS分析中各個(gè)mAb對(duì)應(yīng)的色譜梯度見表2。iCIEF-MS在線直連分析，其連接示意圖如圖1所示。iCIEF-HRMS和SCX-HRMS中使用的高分辨質(zhì)譜均以O(shè)rbitrap為檢測(cè)器。

表1. 用于研究的九種mAb等電點(diǎn)及iCIEF分析溶液體系配比。

表2. SCX-MS分析所用色譜梯度。

圖1 iCEF-MS在線直連系統(tǒng)連接示意圖。

結(jié)果與討論

iCIEF和SCX對(duì)9種單克隆抗體的分離效果

經(jīng)過方法優(yōu)化后，分別使用iCIEF-UV和SCX-UV技術(shù)，每個(gè)mAb的電荷變異體均可在10分鐘之內(nèi)得到分離（圖2）。對(duì)于多數(shù)樣品，iCIEF的分離效果要優(yōu)于SCX。以infliximab為例，使用iCIEF，4個(gè)電荷異質(zhì)體峰及主峰能實(shí)現(xiàn)基線分離，而SCX的分離稍遜；pembrolizumab，atezolizumab及denosumab也能觀察到類似現(xiàn)象。

圖2. 九種mAb iCIEF-UV及SCX-UV譜圖對(duì)比。

 iCIEF-MS及SCX-MS譜圖對(duì)比

圖3. Atezolizumab iCIEF-MS及SCX-MS譜圖對(duì)比。左，UV檢測(cè)器（280nm）譜圖。右，質(zhì)譜總離子流圖（TIC）。UV檢測(cè)器與質(zhì)譜為在線串聯(lián)模式。

圖3展示了分別使用iCIEF-MS及SCX-MS對(duì)atezolizumab電荷變異體進(jìn)行鑒定的結(jié)果對(duì)比。對(duì)于SCX分離，其出峰順序在UV和MS兩個(gè)檢測(cè)器上是一致的。需要注意的是，當(dāng)使用iCIEF作為分離手段時(shí)，UV圖上Z 右邊的堿峰會(huì)Z 先被推入質(zhì)譜中，所以iCIEF-UV和iCIEF-MS的酸-堿峰順序呈鏡像關(guān)系。相較于iCIEF-MS，SCX-MS可以維持較窄的峰寬和較對(duì)稱的峰型 。SCX-MS的峰輪廓與SCX-UV較為接近。此外，SCX-MS分析時(shí)使用常規(guī)流速(200~300μL/min)，10-15 min即可完成一個(gè)樣品的電荷異構(gòu)體分析。iCIEF-MS分析時(shí)需要先分離聚焦，聚焦完成后再推出卡柱檢測(cè)，樣品從卡柱推出的液體流速50~100nL/min，整體的分離檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)（每個(gè)樣品1 h左右）。iCIEF-MS加上輔助鞘液后Z 終離子源處流速范圍在5~10μL/min，低流速導(dǎo)致的峰展寬效應(yīng)比較明顯，尤其是主峰，可能會(huì)與酸峰有一定程度的重疊。使用窄pH范圍的電解質(zhì)和新材料涂層的分離卡柱可以在一定程度上克服峰展寬導(dǎo)致的分離度損失。

低流速為iCIEF-MS帶來(lái)了峰展寬效應(yīng)和分析檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的問題，但使用低流速的iCIEF-MS相對(duì)于使用常規(guī)流速的SCX-MS具有更高的靈敏度。如圖4所示，以atezolizumab為例，僅需約1/10的上樣量，iCIEF-MS即可達(dá)到與SCX-MS相同的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度。得益于Orbitrap平臺(tái)的高靈敏度(圖4C)，在樣品濃度僅為0.05mg/mL時(shí)，對(duì)于每個(gè)電荷變異體，仍可得到高信噪比的質(zhì)譜譜圖用于完整分子量分析。

圖4. 使用iCIEF-MS對(duì)atezolizumab進(jìn)行表征。（A），濃度0.05-2mg/mL atezolizumab的iCIEF-UV譜圖。（B），總離子流（TIC）圖。（C），質(zhì)譜圖。（D），蛋白濃度v.s.質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度。

在質(zhì)量精度方面， iCIEF-MS和SCX-MS均具有較好的表現(xiàn)。但由于iCIEF-MS在酸性條件下檢測(cè)，不會(huì)造成明顯的溶劑加合效應(yīng)，而SCX-MS在近native的狀態(tài)下洗脫，存在一定的溶劑加合，因此iCIEF-MS分析的質(zhì)量精度稍優(yōu)于SCX-MS（表3）。

表3. iCIEF-MS與SCX-MS分析

atezolizumab電荷變異體結(jié)果對(duì)比。

用atezolizumab評(píng)估iCIEF-MS在蛋白鑒定中的重現(xiàn)性

圖6展示了五針atezolizumab重復(fù)進(jìn)樣（第 一天進(jìn)樣兩針，第二天進(jìn)樣三針）用于評(píng)估iCIEF-MS系統(tǒng)重現(xiàn)性的結(jié)果。所有進(jìn)樣中電荷變異體的質(zhì)量偏差均小于10 ppm（表4），證明iCIEF-MS的重現(xiàn)性可以滿足批次間樣品對(duì)比的需求。

圖6. 使用atezolizumab評(píng)估iCIEF-MS系統(tǒng)重現(xiàn)性（n=5）。總共進(jìn)樣五針，其中第 一天兩針，第二天三針。

表4. iCIEF-MS分析atezolizumab

電荷變異體分子量穩(wěn)定性（n=5）

iCIEF-MS分析多種mAb

研究人員使用iCIEF-MS技術(shù)，對(duì)表1中所列的9種mAb電荷異質(zhì)性分別進(jìn)行了分析，包括糖化在內(nèi)的多種重要修飾均得到了鑒定。圖7展示了9種mAb的iCIEF-UV與iCIEF-TIC對(duì)比圖，表5則列出了9種mAb所有鑒定到的電荷變異體。

圖7. 9種mAb的iCIEF-MS分析結(jié)果匯總。

表5. iCIEF-MS分析9種mAb的電荷變異體分子量列表匯總

延伸閱讀（非文獻(xiàn)內(nèi)容）

賽默飛的兩種電荷異構(gòu)體技術(shù)，SCX-MS和iCIEF-MS均可以實(shí)現(xiàn)單抗的電荷異構(gòu)體分析。兩種技術(shù)都具有各自的優(yōu)勢(shì)，讀者可按需選用，也可以兩種技術(shù)均使用，結(jié)果互為印證。

結(jié)論

在蛋白電荷異質(zhì)體的表征中，iCIEF-MS和SCX-MS是兩種常見的策略。在本文的研究中，研究人員選取了9種mAb，分別使用iCIEF-MS和SCX-MS進(jìn)行電荷異質(zhì)體的表征，并從方法學(xué)層面對(duì)這兩種策略進(jìn)行了對(duì)比。兩種方法在蛋白電荷異質(zhì)體表征方面均能提供可信結(jié)果，且互為支持和補(bǔ)充。