溶液配制
氨基酸儲(chǔ)備液：? 稱(chēng)取一定量氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，胱氨酸為0.01 mol/L，酪氨酸為0.02 mol/L，其他氨基酸為0.05 mol/L
氨基酸使用液：? 將儲(chǔ)備液用0.1 mol/L HCl水溶液稀釋?zhuān)玫綕舛葹?.002 mol/L的氨基酸單標(biāo)和混標(biāo)
內(nèi)標(biāo)液：? 以正亮氨酸作為內(nèi)標(biāo)物。稱(chēng)取一定量正亮氨酸，溶于0.1 mol/L HCl水溶液，得到0.02 mol/L的正亮氨酸內(nèi)標(biāo)液
異硫氰酸苯酯溶液：? 將250 μL異硫氰酸苯酯用乙腈乙腈定容至10 mL，得到0.2 mol/L異硫氰酸苯酯溶液
三乙胺溶液：? 將1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL，得到1.0 mol/L三乙胺溶液

衍生化

樣品溶液衍生化

? ? ? ? 量取200 μL 樣品溶液(蛋白質(zhì)水解液或游離氨基酸溶液)[1]，置于1.5 mL 塑料離心管中，加入20 μL 正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液[2]，混勻，再加入100 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 μL 0.2 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液，混勻，室溫反應(yīng)1小時(shí)，然后加入400 μL正己烷，旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合[3]，0.22 μm 針式過(guò)濾器過(guò)濾，待分析。

標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化
? ? ? ? 量取200 μL氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(每種組分濃度均為0.002 mol/L)，置于1.5 mL塑料離心管中，準(zhǔn)確加入20 μL正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液[2]、100 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 μL 0.2 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液，混勻，室溫反應(yīng)1小時(shí)，然后加入正己烷400 μL，旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合[3]，0.22 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾，待分析。

注：
[1] 通過(guò)控制原始樣品質(zhì)量或稀釋等方法，使樣品溶液中的氨基酸總量不超過(guò)0.04 mol/L或3.0 g/L(兩者中取Z小值)
[2] 只有采用內(nèi)標(biāo)法分析時(shí)，才需要加入正亮氨酸作為內(nèi)標(biāo)物
[3] 衍生得到的樣品溶液中含有50%的乙腈，這與流動(dòng)相溶劑體系存在較大差距，因而需要加水稀釋?zhuān)駝t會(huì)引起峰前沿或分叉

分析條件
儀器: 二元高壓HPLC系統(tǒng)
色譜柱: Diamonsil AAA 250 × 4.6 mm，5 μm（Cat.#：99751）
流動(dòng)相A: 0.05 mol/L乙酸鈉水溶液(冰乙酸調(diào)節(jié)pH值為6.50 ± 0.05)
流動(dòng)相B: 甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20(V : V : V)
流速: 1.0 mL/min
檢測(cè)波長(zhǎng): UV 254 nm
柱溫: 45 ℃
進(jìn)樣體積: 10 μL
梯度程序

該方法適用于氨基酸注射液、動(dòng)植物性食品和飼料中Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(絲氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(組氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(蘇氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(纈氨酸)、Met(蛋氨酸)、Cys(胱氨酸)、Ile(異亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(賴(lài)氨酸)等18種天然氨基酸的檢測(cè)。

18種天然氨基酸、正亮氨酸以及NH3(氨)-異硫氰酸苯酯衍生物的液相色譜圖

1 Asp(天冬氨酸) 2 Glu(谷氨酸) 3 Ser(絲氨酸) 4 Gly(甘氨酸) ?5 His(組氨酸) 6 Arg(精氨酸) 7 Thr(蘇氨酸) 8 Ala(丙氨酸) ?9 Pro(脯氨酸) 10 NH3(氨) 11 Tyr(酪氨酸) 12 Val(纈氨酸) ?13 Met(蛋氨酸) 14 Cys(胱氨酸) 15 Ile(異亮氨酸) 16 Leu(亮氨酸) ?17 Nle(正亮氨酸) 18 Phe(苯丙氨酸) 19 Trp(色氨酸) 20 Lys(賴(lài)氨酸)