質(zhì)粒DNA被大量用于基因治 療藥物以及mRNA疫苗的DNA模板的制備中。另外，美國(guó)FDA還發(fā)布了質(zhì)粒DNA藥物的指導(dǎo)方針[1]，這些都表明質(zhì)粒DNA的質(zhì)量控制和分析方法變得越來(lái)越重要。

質(zhì)粒DNA藥物的質(zhì)量項(xiàng)目、標(biāo)準(zhǔn)及分析法

下表中歸納了質(zhì)粒DNA藥物的質(zhì)量項(xiàng)目、分析法以及標(biāo)準(zhǔn)示例[2]。其中，對(duì)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析的質(zhì)粒DNA的均一性，規(guī)定了閉環(huán) (sc或ccc) 狀的純度應(yīng)在80%以上。另外還需要對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)體中的開環(huán) (oc) 狀、直鏈 (linear) 狀以及二聚體、多聚體等項(xiàng)目分別進(jìn)行分離和確認(rèn)。在分析這些項(xiàng)目時(shí)，HPLC是一種有效的方法。

分析質(zhì)粒DNA的拓?fù)洚悩?gòu)體

培養(yǎng)后，通過(guò)溶菌作用獲得粗提質(zhì)粒DNA，然后使用陰離子交換色譜柱TSKgel DNA-NPR將其分離，得到的色譜柱如下圖[3]所示。

質(zhì)粒DNA的拓?fù)洚悩?gòu)體按照oc狀、sc (ccc) 狀、linear狀、二聚體 (多聚體) 的順序依次洗脫出來(lái)[4]。另外，我們都知道，根據(jù)分析柱的物性和流速等分析條件，linear狀質(zhì)粒DNA的洗脫位置會(huì)發(fā)生變化[5]。

因此，為了正確識(shí)別這些拓?fù)洚悩?gòu)體，需要通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳 (包括對(duì)比分解酶處理樣品的電泳) 和電子顯微鏡照片，確認(rèn)通過(guò)色譜法得到的組分[5]。

核酸分離用IEC色譜柱的選擇

TSKgel DNA-NPR和TSKgel DNA-STAT這兩款陰離子交換色譜柱都可用于分離核酸，都采用了非多孔性填料，但填料粒徑和色譜柱尺寸不同，分離選擇性也稍有不同。

TSKgel DNA-NPR (4.6 mmI.D.×7.5 cm, 2.5 μm) 更適合用于分析質(zhì)粒DNA，能夠簡(jiǎn)便、快速地區(qū)分出超螺旋、開環(huán)和線型三種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。TSKgel DNA-STAT (4.6 mmI.D.×10 cm, 5 μm) 更適合分析寡核苷酸和DNA片段。

核酸分離用陰離子交換色譜柱產(chǎn)品信息

參考文獻(xiàn)

[1] Center for Biologics Evaluation and Research, Guidance for Industry, Considerations for plasmid DNA vaccines for infectious disease indications, US FDA, November 2007.

[2] J. Whitely et al., Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics: mRNA platform requirements and development of a scalable production process to support early phase clinical trials, Volume 242, April 2022, Pages 38-55.

[3] J. Urthaler et al., Improved downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy, Acta Biochmica Polonica, 52 (2005) 703-711.

[4] S. G. L. Quaak et al., Naked Plasmid DNA Formulation: Effect of Different Disaccharides on Stability after lyophilization, AAPS PharmSciTech, 11 (2010) 344-350.

[5] C. R. Smith et al., Separation of topological forms of plasmid DNA by anion-exchange HPLC; Shifts inn elution order of linear DNA, J. Chromatogr. B., 854 (2007) 121-127.