【概述】

氯羥吡啶（3,5-二氯-2,6-二甲基-4-羥基吡啶），其商品名為克球粉（coyden），是一種預(yù)防雞球蟲病的飼料藥物添加劑，氯羥吡啶對9種雞艾美耳球蟲的FZ均有良好效果且價格便宜，因此在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，但長期使用或不按照規(guī)定使用將會造成氯羥吡啶在動物性食品中殘留。有研究顯示氯羥吡啶具有一定的致畸性和胚胎毒副作用[1]，現(xiàn)在，歐盟已全面禁止氯羥吡啶在動物性食品生產(chǎn)中使用，日本也禁止氯羥吡啶用于家禽。我國規(guī)定氯羥吡啶在雞肉中的殘留限量為10μg/kg[2]，牛奶中為20μg/kg[3]。

【實驗/設(shè)備條件】

色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；

柱溫：90℃（1 min），30℃/min到200℃，5℃/min到205℃（1min），30℃/min到280℃（10 min）；

進樣模式：不分流進樣，不分流時間為1min；進樣量：2 μL；

進樣口溫度：250℃；

載氣：氦氣（99.999%），恒流模式，1 mL/min；

質(zhì)譜離子源溫度：300℃，傳輸線溫度：300℃；

掃描模式：選擇離子監(jiān)測模式，m/z=248，263，212，214，定量離子為248

【樣品提取】

樣品前處理

雞肉樣品：稱取2.0 g于50 mL離心管中，加入乙腈10 mL，于漩渦混勻器上振蕩1 min，再加入氯化鈉1.0 g，繼續(xù)振蕩1 min。于10000 rpm離心10 min，取上清液2.5 mL待凈化。

堿性氧化鋁小柱（2g，6mL）上層填入1.0g無水硫酸鈉，先用5mL甲醇、5mL乙腈活化，然后加入待凈化的樣品，再用10mL甲醇洗脫，用試管接收甲醇洗脫液，將洗脫液在55℃下氮氣吹干。待衍生。

牛奶樣品：稱取樣品1.0 g于50 mL離心管中，加入乙腈5 mL，于漩渦混勻器上振蕩1 min，再加入氯化鈉1.0 g，繼續(xù)振蕩1 min。于10000 rpm離心10 min，取上清液2.5 mL待凈化。

堿性氧化鋁小柱（2g，6mL）上層填入1.0g無水硫酸鈉，先用5mL甲醇、5mL乙腈活化，然后加入待凈化的樣品，

再用10mL乙腈淋洗小柱，待自然流下近干后用10mL甲醇洗脫，用試管接收甲醇洗脫液，將洗脫液在55℃下氮氣吹干。待衍生。

衍生：在上述試管中加入100μL甲苯溶解殘渣，再加入100μL衍生試劑，密封后于80℃衍生60min，冷卻后加入800μL甲苯，混勻后過0.22μm濾膜，待GCMS分析。

【實驗/操作方法】

本研究建立了一種簡單、靈敏、可靠的檢測動物源性食品中氯羥吡啶殘留量的方法。方法檢出限為5μg/kg，遠遠低于我國對雞肉和牛奶中氯羥吡啶的限量要求。

【實驗結(jié)果/結(jié)論】

前處理條件的優(yōu)化：采用乙腈為提取溶劑，提取效率較高，加入氯化鈉使乙腈與水分層，避免水對后續(xù)分析的影響。

用堿性氧化鋁小柱凈化時，用甲醇洗脫氯羥吡啶，可得到滿意的回收率。

儀器分析方法優(yōu)化：以全掃描的方式對氯羥吡啶三甲基硅醚衍生物進行測定，得到其質(zhì)譜圖（圖1）。根據(jù)其全掃描質(zhì)譜圖和保留時間，選擇氯羥吡啶衍生物的定性和定量的特征目標監(jiān)測離子。測定時，可根據(jù)標準物和待測物的定量離子流圖中的峰面積，外標法定量。確證時，可根據(jù)碎片離子及其豐度比作為其陽性判別的依據(jù)。

在選定的色譜條件下，標準品衍生后得到產(chǎn)物的色譜圖見圖2。

圖1.氯羥吡啶的三甲基硅醚衍生物的質(zhì)譜圖

圖2.氯羥吡啶標準溶液衍生后的全掃描譜圖

線性關(guān)系及測定低限：準確移取氯羥吡啶標準溶液適量，氮氣吹干后按上述所述步驟進行衍生，得到濃度為0、2.5、5、10、20、50 μg/L的一系列標準工作液，供氣相色譜質(zhì)譜測定。以測定峰面積為縱坐標，對應(yīng)的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線如圖3。方法檢出限以3倍信噪比計算得到，本方法的測定低限為5 μg/kg。

圖3.氯羥吡啶三甲基硅醚的線性情況

回收率及精密度實驗：用標準添加法，在空白樣品中，添加氯羥吡啶標準溶液，做加標回收實驗，按規(guī)定方法進行提取、凈化和測定，添加濃度為5μg/kg、20μg/kg和100μg/kg三個水平，各做3個平行，空白樣品、添加譜圖見圖4，結(jié)果見表1。

圖4a.牛奶樣品空白和樣品加標譜圖（黑色為標準溶液衍生產(chǎn)物譜圖，藍色為樣品空白，紫色為樣品加標）

圖4b.雞肉樣品空白和樣品加標譜圖（黑色為標準溶液衍生產(chǎn)物譜圖，藍色為樣品空白，紫色為樣品加標）

表1a.空白牛奶樣品添加實驗回收率和精密度

表1b.空白雞肉樣品添加實驗回收率和精密度

結(jié)論

動物源性樣品中的氯羥吡啶用乙腈提取后，堿性氧化鋁小柱凈化后，經(jīng)過衍生，采用賽默飛世爾新型的氣相色譜質(zhì)譜儀檢測和確證，外標法定量。結(jié)果表明，方法的平均回收率為61.60-101.62%，3次平行測定的RSD值≤11.57%，方法測定低限為5μg/kg。此法操作簡單，科學(xué)準確，靈敏度高，能夠滿足動物源性食品中氯羥吡啶的殘留分析要求。

【儀器/耗材清單】

儀器

Trace1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配EI源（ThermoScientific）；AS1310自動進樣器（Thermo Scientific）

恒溫干燥箱（Thermo Scientific）

離心機（Thermo Scientific）

天平

漩渦混合器（Thermo Scientific）

耗材

色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）（Thermo Scientific,PN：26098-1420）

堿性氧化鋁固相萃取小柱：2g，6mL

試劑與標準品

氯羥吡啶標準品：含量≥99%；

甲苯、乙腈、甲醇均為色譜純(Thermofisher)；無水硫酸鈉：

優(yōu)級純，使用前在馬弗爐內(nèi)450℃灼燒4h，于干燥器中冷卻備用；氯化鈉：分析純；衍生劑：Sylon BFT（即體積比為99:1的N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷）

【參考文獻】

[1]姜中其,包鴻俊,史曉麗.氯羥吡啶的特殊毒性-致畸作用.ZG獸醫(yī)學(xué)報, 1999, 19(4): 390-392

[2]莊天忌.各國食品和飼料中農(nóng)藥獸藥殘留限量大全.北京:ZG對外經(jīng)濟貿(mào)易出版社, 1995: 983

[3]農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局.農(nóng)業(yè)部發(fā)布動物性食品中獸藥Z高殘留限量:續(xù).ZG獸藥雜志, 2003, 37(3): 5-11

[4] Suzuki E, Matsuda M, Momose A, et al. Improved method for gas chromatographic determination of clopidol in chicken tissues. JAssoc of Anal Chem, 1980, 63: 1211-1214

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[6]應(yīng)永飛,皮雄娥,林仙軍.GX液相色譜法測定兔肉中氯羥吡啶.理化檢驗-化學(xué)分冊, 2007, 43(2): 741-742

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[8]皮雄娥,應(yīng)永飛,費迪波,等.雞肉中氯羥吡啶的GX液相色譜法測定.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2005, 17(4): 200-202

[9]張睿,段紅安.禽肉中氯羥吡啶殘留量的GC/MS測定法.ZG獸藥雜志, 2002, 38: 39-41

[10]劉祥國,蘇怡娟,方炳虎等.氣相色譜質(zhì)譜法測定雞肉組織中殘留的氯羥吡啶.色譜, 2009, 27(1):86-90

[11] Macneil JD. Committee on drugs and related topics-drug residues in animal tissues. Journal of AOAC International, 2003,86(1): 116-127