目的
這篇技術(shù)說明是為了幫助用戶建立Z佳的熒光偏振檢測(cè)方法，引導(dǎo)如何將現(xiàn)有的多種測(cè)定方法轉(zhuǎn)換為可靠、靈敏的熒光偏振檢測(cè)。在本文中，我們以常見的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)——受體和配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)為例來(lái)說明這個(gè)問題。

設(shè)計(jì) FP 受體 - 配體結(jié)合測(cè)定時(shí)應(yīng)考慮的要點(diǎn)
1. Z大限度地增大示蹤劑和受體之間的尺寸差異。 當(dāng)使用常見的熒光染料如熒光素、Texas Red、Cy5、BODIPY 等，示蹤劑的大小應(yīng)小于 10kd，與肽相當(dāng)，而受體大小應(yīng)為 50kd 或者更大。通常認(rèn)為，兩者之間10 倍的分子量差異是比較好的。不過，如果不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)也可以嘗試開展結(jié)合實(shí)驗(yàn)的評(píng)估，畢竟Z初的FP 實(shí)驗(yàn)工作是使用白蛋白 (60 kD) 和抗體 (160 kD) 獲得了可發(fā)表的結(jié)果。
2. 盡量減少其它檢測(cè)材料對(duì)非特異性熒光偏振的影響。品質(zhì)因素包括示蹤劑的純度，受體的純度，緩沖液固有的熒光以及緩沖液組分如載體蛋白與示蹤劑結(jié)合的能力。一些微孔板的材料如聚苯乙烯能夠結(jié)合游離示蹤劑，從而增加總極化，可使用非結(jié)合表面的微孔板來(lái)解決這個(gè)問題。
2a. 示蹤劑應(yīng)該大于 90% 的標(biāo)記比率。 高百分比的未能標(biāo)記的示蹤劑意味著未標(biāo)記的示蹤劑將競(jìng)爭(zhēng)受體，從而改變表觀 IC50 ( 相互作用的表觀親和力，從而影響 IC50 的計(jì)算值 )。同樣，無(wú)法從示蹤劑中純化出游離熒光基團(tuán)意味著增加的總熒光部分將無(wú)法改變其偏振態(tài)。
2b. 使用高度提純的受體。 由于大蛋白，細(xì)胞膜和細(xì)胞碎片會(huì)散射光，導(dǎo)致總極化凈增加，因此應(yīng)盡量減少這些雜質(zhì)。適當(dāng)?shù)谋尘翱鄢梢詫?duì)它們進(jìn)行部分校正，但是zui好的方法是使用純化的受體，這將對(duì)信號(hào) ( 以及由此產(chǎn)生的噪聲 ) 的影響降至Z低。另外，受體制劑的反復(fù)凍融可能會(huì)導(dǎo)致聚集增加，從而降低其檢測(cè)性能，采用窄口注射器進(jìn)行破碎以及沉降 / 離心等方法來(lái)去除聚集物。
2c. 減少緩沖溶液對(duì)信號(hào)的影響。 緩沖液熒光本底的增加是由于污染物在目標(biāo)波長(zhǎng)下發(fā)出熒光，應(yīng)將原材料，混合和儲(chǔ)存容器的清潔度以及緩沖液的制備方法降至可接受的水平，因?yàn)榫彌_液或非熒光團(tuán)成分導(dǎo)致的高本底會(huì)嚴(yán)重影響 FP 測(cè)定的信噪比以及Z終的檢測(cè)靈敏度。
2d. 避免 BSA 干擾。 蛋白質(zhì)緩沖液通常包括載體蛋白，例如牛血清白蛋白 (BSA)，白蛋白可能會(huì)結(jié)合某些熒光團(tuán)，這可能會(huì)增加熒光基線值，縮小測(cè)定范圍。解決方案包括避免使用載體蛋白或使用低結(jié)合的替代物，如牛丙種球蛋白(BGG)。在任何情況下，通過比較添加和不添加蛋白質(zhì)的緩沖液中示蹤劑的極化，來(lái)評(píng)估緩沖蛋白對(duì)示蹤劑凈極化的影響都是一個(gè)有效的方法?；蛘撸ㄟ^降低BSA 的Z終濃度來(lái)Z小化這些影響。
3. 確定實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)確定微孔板的類型，實(shí)驗(yàn)體積以及檢測(cè)速度與檢測(cè)靈敏度 / 精密度的相對(duì)重要性，zui好在接近Z終實(shí)驗(yàn)條件的條件下進(jìn)行可行性研究，測(cè)定可行性可以采用大于目標(biāo)體積的實(shí)驗(yàn)體積。
4. 確定開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。 與 HTS 的單孔實(shí)驗(yàn)相比，F(xiàn)P 的實(shí)驗(yàn)方案開發(fā)和驗(yàn)證通常需要更多的重復(fù)和對(duì)照，評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)包括試劑消耗量，讀取時(shí)間，孵育時(shí)間和條件，信噪比 ( 見下文 )，精度，靈敏度和重現(xiàn)性等。

建立和優(yōu)化 FP 受體 - 配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)的步驟
1. 確定儀器的Z佳參數(shù)設(shè)置。 如果使用 MolecularDevices 公司的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行 FP 結(jié)合實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，我們建議優(yōu)化以下參數(shù)：PMT 設(shè)置、Z 軸高度、積分時(shí)間或者每孔閃爍次數(shù)。
2. 確定游離示蹤劑的Z佳濃度。 此步驟通過檢查產(chǎn)生的信號(hào)和偏振的濃度獨(dú)立性來(lái)確定示蹤劑濃度的可接受范圍。選擇使用可提供良好信噪比的Z低示蹤劑濃度 , 另外，還有一些生化方面的考慮，示蹤劑的濃度應(yīng)小于 Kd ( 如果已知 )，并且應(yīng)小于受體的濃度。比較游離示蹤劑與游離熒光團(tuán)的 mP 值 ( 同時(shí)檢測(cè)游離熒光團(tuán) ) 可確定示蹤劑大小的適用性。 如果示蹤劑的 mP顯著大于游離熒光團(tuán)的 mP，說明示蹤劑可能太大而無(wú)法用于 FP。
2a. 使用 4 個(gè)或更多重復(fù)樣本對(duì)游離示蹤劑進(jìn)行連續(xù)稀釋 ( 例如，從 100 nM 到 0.1 nM )。
2b. 在研究示蹤劑的同時(shí)，評(píng)估游離熒光團(tuán)， 對(duì)游離熒光團(tuán) ( 如用于標(biāo)記示蹤劑的熒光團(tuán) ) 以 4 個(gè)或更多的重復(fù)進(jìn)行連續(xù)稀釋 ( 例如從 100 nM 到 0.1nM )。每個(gè)濃度至少應(yīng)重復(fù) 4 個(gè)點(diǎn)，以便隨后對(duì)背景“ 噪聲 ”水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估。
2c. 實(shí)驗(yàn)體系中應(yīng)包含僅是緩沖液的空白對(duì)照，以便進(jìn)行背景扣除。計(jì)算空白對(duì)照的垂直偏振 S 平均值和水平偏振 P 平均值，然后從包含示蹤劑和游離熒光團(tuán)的孔的各個(gè) S 和 P 值中減去空白對(duì)照平均值，完成背景扣除。
2d. 使 用文獻(xiàn)中熒光染料 的理 論 mP ( 如熒光素和Texas Red 為 27 ) 以及合適濃度下游離熒光團(tuán)的偏振值計(jì)算得出 G 因子，當(dāng)游離熒光團(tuán)的 S 和 P值均遠(yuǎn)高于背景值 ( 緩沖液空白對(duì)照值 ) 的時(shí)候，該濃度被認(rèn)定是合適的。G 因子的計(jì)算公式為：G= S/P *[(1-27/1000)/(1+27/1000)]，其中游離熒光團(tuán)的 S 和 P 值是已經(jīng)扣除背景之后的數(shù)值。
2e. 游離示蹤劑熒光偏振值 mP 的計(jì)算公式為：mP=[(S - P*G)/(S + P*G)]*100，使用步驟 2d 中計(jì)算得到的 G 因子，S 和 P 值同樣是扣除背景之后的數(shù)值。作為對(duì)照，游離熒光團(tuán)的 mP 值應(yīng)接近于理論值。理想情況下，示蹤劑的值應(yīng)接近游離熒光團(tuán)的值，這表明配體的大小和旋轉(zhuǎn)速度受熒光團(tuán)的綴合影響很大。如果該值大得多，則表明示蹤劑可能足夠大，足以降低與受體結(jié)合時(shí)的有效偏振變化。示蹤劑的可接受濃度范圍包括偏振值 (mP) 接近規(guī)定的 27 mP 的所有濃度。示蹤劑的原始信號(hào)值應(yīng)至少是緩沖液空白信號(hào)的 3 倍。
以熒光強(qiáng)度 (FI) 模式重新讀板可評(píng)估游離示蹤劑的淬滅程度， 淬滅效應(yīng)會(huì)影響基于熒光強(qiáng)度測(cè)量的Z終檢測(cè)靈敏度。比較游離溶液中熒光團(tuán)標(biāo)記的分子與熒光團(tuán)本身的摩爾熒光強(qiáng)度，確定化學(xué)偶聯(lián)過程本身造成的淬滅程度，例如，如果沒有淬滅，1nm 熒光肽的信號(hào)應(yīng)該與 1nm 熒光素鈉的信號(hào)相同。如果另一分子偶聯(lián)的熒光素比游離熒光素具有更高的熒光信號(hào)，這可能表明我們選擇了不合適的示蹤劑濃度。同樣，如果示蹤劑的信號(hào)少于相同濃度的游離標(biāo)記物信號(hào)的 20％，那么它很有可能是被高度淬滅了，這可能是由示蹤劑過低的標(biāo)記百分率，不合適的濃度或者更多組合因素造成的。
值得注意的是，熒光偏振往往會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度損失約 10–90％，相對(duì)于直接的熒光強(qiáng)度測(cè)量，這本身可能會(huì)降低熒光偏振的靈敏度。
3. 使用適當(dāng)?shù)膮⒄諚l件滴定受體。 此步驟的目的是確定受體和示蹤劑的Z佳濃度。使用適當(dāng)?shù)膮⒄諚l件可以精確估計(jì)特定的偏振。在存在示蹤劑和不存在示蹤劑的兩種條件下，測(cè)試多種濃度的受體 (“ 蛋白質(zhì) ”)。由于受體可能會(huì)產(chǎn)生凈信號(hào)，所以不存在示蹤劑的受體可以作為一個(gè)參照。 對(duì)于多種濃度的受體，每種受體均應(yīng)設(shè)置僅是緩沖液的空白參照。受體的濃度應(yīng)該高于示蹤劑的濃度。Z初可以嘗試多種濃度的示蹤劑，其濃度應(yīng)該在 Kd 以下，初次實(shí)驗(yàn)可能使用的示蹤
劑和受體的濃度范圍比較寬泛，而后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以只使用固定濃度的示蹤劑和一系列緊湊有限稀釋的受體。從 4X Kd 滴定受體，從 1X Kd 滴定示蹤劑是一個(gè)不錯(cuò)的開始。對(duì)于早期實(shí)驗(yàn)，至少進(jìn)行三次重復(fù) ; 增加重復(fù)的數(shù)量可以更準(zhǔn)確地估計(jì)測(cè)定的不精確性。為了能夠準(zhǔn)確確定實(shí)驗(yàn)的不精確性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)至少重復(fù)三次。具體的參照組包括：
3a. 緩沖 液空白對(duì)照：表示緩沖液對(duì) S 和 P 信號(hào)的影響，特別是當(dāng)緩沖液中存在干擾分子時(shí) ( 如蔗糖 )。它被用作僅有示蹤劑的對(duì)照孔信號(hào)的背景扣除。
3b. 示蹤劑對(duì) 照：背景 扣除后 的 S 和 P 值用于 G 因子計(jì)算，計(jì)算公式：G = S / P * [(1-27 / 1000)/(1 +27/1000)]，其中 S 和 P 值是游離示蹤劑的 S 和 P值減去了緩沖液空白對(duì)照的 S 和 P 值。G 因子應(yīng)該是一個(gè)非常穩(wěn)定的值，并且在之前計(jì)算出的值應(yīng)該是合適的，不過此時(shí)有必要對(duì) G 因子進(jìn)行早期估算。
值得注意的是，信號(hào)/噪聲的代表值可以從示蹤劑對(duì)照的 S 值計(jì)算出來(lái)，理論上，示蹤劑對(duì)照的信號(hào)至少是緩沖液空白對(duì)照信號(hào)的 10 倍。
3c. 蛋白質(zhì)對(duì)照：表示特定蛋白受體對(duì)光散射的影響，尤其是膜結(jié)合受體。它被用作 [ 蛋白質(zhì) + 示蹤劑 ]對(duì)照孔信號(hào)的背景扣除。因?yàn)橐褂脦追N濃度的蛋白質(zhì)，所以每一種濃度都應(yīng)在沒有示蹤劑的情況
下進(jìn)行測(cè)試，計(jì)算出的平均 S 和 P 值被各個(gè)孔的 S和 P 值減去以獲得 mP。
3d. [ 蛋白質(zhì) + 示蹤劑 ] 對(duì)照：確定 mP 的Z大值。根據(jù)蛋白質(zhì)的滴定與示蹤劑的滴定來(lái)確定蛋白質(zhì)和示蹤劑的Z佳濃度，這是熒光偏振測(cè)定的關(guān)鍵內(nèi)容。如上所述，從 4X Kd 滴定蛋白質(zhì)，從 1X Kd 滴定示蹤劑是一個(gè)良好的開始。
如果受體的濃度是 Kd，并且示蹤劑的濃度小于受體，那么受體應(yīng)綁定一半濃度的示蹤劑。蛋白質(zhì) +示蹤劑對(duì)照孔的 S 和 P 值要減去蛋白質(zhì)對(duì)照孔的信號(hào)值。對(duì)于背景扣除，計(jì)算蛋白質(zhì)對(duì)照孔的 S 和P 值的平均值，然后用含示蹤劑、蛋白質(zhì)和化合物/ 對(duì)照孔的各個(gè) S 和 P 值減去適當(dāng)?shù)木?。采用從步驟 2b 中計(jì)算出的 G 因子。
3e. 有三個(gè)參數(shù)可以評(píng)估：減去背景的 mP 值，測(cè)定的不精確度和極化變化。不精確度是每組 mP 值均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，通常應(yīng)小于 10 mP。極化變化時(shí)的測(cè)定范圍由 [ 蛋白質(zhì) + 示蹤劑 ] 對(duì)照的平均 mP 減去游離示蹤劑的平均 mP 計(jì)算得出。應(yīng)存在一個(gè)平臺(tái)效應(yīng)，即超過Z佳的受體濃度不會(huì)使 mP 進(jìn)一步增加。受體濃度的不精確度小于 10mp，且mP 的Z大變化能提供Z大的測(cè)定范圍。不過，受體濃度略低于平臺(tái)期可以提供更好的性能，并消耗更少的貴重試劑。 理想情況下，極化的凈變化應(yīng)大于 70 mP。
4. 一種或多種測(cè)定方案中的效價(jià)競(jìng)爭(zhēng)分子。 競(jìng)爭(zhēng)分子可能是未標(biāo)記的示蹤劑或已知抑制示蹤劑與受體結(jié)合的其它分子。示蹤劑和受體的濃度以步驟 3 中確定的濃度為準(zhǔn)，可以大大提高 mP；現(xiàn)在添加競(jìng)爭(zhēng)分子會(huì)使極化返回到自由示蹤劑的極化。使用競(jìng)爭(zhēng)分子的 2 倍，
3 倍或 5 倍的稀釋系列，并將稀釋的濃度值轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)以獲得Z具描述性的結(jié)果，這應(yīng)該是一個(gè) S 型抑制曲線，可給出極化凈減少 50％ 的中點(diǎn)是 IC50 ( IC 表示抑制濃度 )，這些值可以與科學(xué)文獻(xiàn)中發(fā)表的值進(jìn)行比較，或通過實(shí)驗(yàn)室中的其他方法獲得，同時(shí)需要評(píng)估不精確度和極化的凈變化。
5. 分析鑒定。 到這一步，我們要考慮實(shí)驗(yàn)中試劑添加步驟的數(shù)量以及將示蹤劑和受體結(jié)合為單一試劑的可能性。并且，競(jìng)爭(zhēng)分子如校準(zhǔn)品，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的體積和緩沖液應(yīng)該與化合物的保持一致，例如，如果要在含 10％ DMSO 的緩沖液中加入化合物，則競(jìng)爭(zhēng)分子也應(yīng)采用這種條件，包括其他對(duì)照組，以評(píng)估系統(tǒng)對(duì)溶劑 (DMSO)，孵育時(shí)間和溫度以及試劑儲(chǔ)存穩(wěn)定性的敏感性。在此階段還可以評(píng)估其他性能標(biāo)準(zhǔn)。
6. 討論。 如果不精確度或凈極化變化不可接受，應(yīng)采取措施評(píng)估不精確度的來(lái)源。不精確度的可能來(lái)源，如移液，儀器，緩沖液，示蹤劑，蛋白質(zhì)等，每個(gè)組成部分都會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的不精確。不精確性的主要 ( Z大 )來(lái)源應(yīng)該是提高測(cè)定性能，這是Z有價(jià)值的方面。對(duì)于凈極化變化不足的情況，可評(píng)估其它示蹤劑或受體( 如果有 )。200 - 300mp ( 或更高 ) 的Z大偏振值是不常見的。許多因素會(huì)導(dǎo)致降低理論上可獲得的Z大極化值，這些影響因素可能是分子自身對(duì)熒光團(tuán)的淬滅，緩沖液淬滅，表面吸附，旋轉(zhuǎn)自旋 (“ 螺旋槳效應(yīng) ”)以及組分之間相互作用的親和力低?？色@得的Z大理論 mP 值為 500 mP，因此，任何大于此值的實(shí)驗(yàn)值都表明測(cè)定中存在假陽(yáng)性，出現(xiàn)這種情況，應(yīng)排查對(duì)照。有時(shí)，某些成分會(huì)產(chǎn)生較大的背景強(qiáng)度值，如果控制不當(dāng)，則會(huì)掩蓋偏振效應(yīng)。作為對(duì)系統(tǒng)的另一項(xiàng)檢查，建議以熒光強(qiáng)度模式重新讀取實(shí)驗(yàn)板。 如果每個(gè)孔中存在相同數(shù)量的示蹤劑，則在熒光強(qiáng)度模式下，整個(gè)板上的強(qiáng)度值應(yīng)相等。然而，如果某些樣品條件本身 ( 如與蛋白質(zhì)結(jié)合 ) 對(duì)熒光有任何特殊的淬滅或增強(qiáng)其效果，或試劑添加步驟的不精確性，這些可以通過強(qiáng)度測(cè)量的變化來(lái)確定。
注意事項(xiàng)
? 控制外部極化。 對(duì)于不是由感興趣的生化結(jié)合事件引起的偏振變化，有兩種方法可以控制。外部偏振的一種來(lái)源是儀器光路中的光學(xué)元件，這可由 G 因子進(jìn)行校正；不相關(guān)極化的第二個(gè)來(lái)源是緩沖液造成的，這可由背景扣除法來(lái)去除。
? Z小 mP。 偏振值 (mP) 表示熒光分子的分子翻滾速率，它與在恒定溫度和黏度下的分子大小和分子形狀有關(guān)。例如，3 kD 的分子的偏振值可能為 30 mP，而 5kD 的分子的偏振值可能為 60 mP。對(duì)于剛性球形熒光素示蹤劑，mP 在其分子大小約 10 kD 時(shí)達(dá)到Z大值，Z大值為 500 mP。
? Z大 mP。 當(dāng)一個(gè)小的游離示蹤劑與大分子結(jié)合時(shí)，預(yù)計(jì) mP 會(huì)增加。 一個(gè)好的 FP 分析通常 mP 值變化為100 或者更大。
? 數(shù)據(jù)分析。 分析性能可以由多種方法來(lái)進(jìn)行評(píng)估和表達(dá)。在描述基于 FP 的受體結(jié)合分析的性能時(shí)，兩個(gè)參數(shù)特別有價(jià)值：第一個(gè)參數(shù)是加入受體后偏振值的凈增加。 這可以通過從 [ 示蹤劑 + 受體 ] 組中減去游離示蹤劑的 mP 來(lái)算出，這是上文中提到的 mP 變化 ; 第二個(gè)參數(shù)是測(cè)量的不精確度，這是信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，單位為 mP。由于這些 FP 分析中的所有實(shí)驗(yàn)組均包含相同數(shù)量的熒光，因此預(yù)期的信號(hào)和該信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)與化合物，蛋白質(zhì)或?qū)φ盏牧炕蜃饔脽o(wú)關(guān)。組合這兩個(gè)參數(shù)的一種有用方法類似于信噪比，其中凈 ( 或“ 增量 ”) mP 對(duì)應(yīng)于信號(hào)，而不精確度 ( 標(biāo)準(zhǔn)偏差 ) 則對(duì)
應(yīng)于“ 噪聲 ”。
? 試劑。 如果你缺少 FP 實(shí)驗(yàn)的試劑，有許多可商購(gòu)的試劑盒用于結(jié)合測(cè)定。