導(dǎo)言
血管生成是由預(yù)先存在的血管所形成和重塑的新血管及毛細(xì)血管的生理過程。這可以通過血管和毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞出芽或分裂來實(shí)現(xiàn)。血管細(xì)胞通過降解細(xì)胞外基質(zhì)對適當(dāng)?shù)拇碳ぷ龀龇磻?yīng)，隨后誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移 1,2。
細(xì)胞經(jīng)歷過這些過程后，形成一個(gè)包含腔的管，一個(gè)動(dòng)態(tài)的空間，促進(jìn)血液流動(dòng)和氧、二氧化碳、一氧化氮和營養(yǎng)物質(zhì)的交換。血管生成是生長發(fā)育、傷口愈合和肉芽組織形成的重要過程。血管生成生長也會(huì)支持腫瘤細(xì)胞在健康組織中的侵襲，在癌癥研究中通常被量化監(jiān)測。當(dāng)血管芽向血管生成刺激源延伸時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞利用黏附分子進(jìn)行縱向遷移。這些芽隨后形成環(huán)狀，利用遷移至此的細(xì)胞形成一個(gè)完整的血管腔。出芽過程在體內(nèi)以每天幾毫米的速度進(jìn)行著，并使新的血管能夠跨越間隙生長。許多抗血管生成藥物已被開發(fā)于癌癥治療，而促血管生成分子則可能在再生應(yīng)用中具有潛力。迄今為止的體外實(shí)驗(yàn)僅模擬了血管生成機(jī)制的某些方面，包括劃痕實(shí)驗(yàn)、博伊登室和管形成實(shí)驗(yàn)。

主要特點(diǎn)
? 可視化血管生成出芽和三維重構(gòu)
? 對血管生成進(jìn)行定量評估，包括芽的數(shù)量、總體積和平均熒光強(qiáng)度
? 使用 OrganoPlate 芯片板獲得與生理相關(guān)的數(shù)據(jù)

MIMETAS 的科學(xué)家開發(fā)了先進(jìn)的、更具生理相關(guān)性的模型，其中包括在促 / 抑制 - 血管生成因子條件下，包埋進(jìn)細(xì)胞外膠質(zhì)基中主血管的實(shí)際生長和出芽。這些誘因既可以通過灌注泳道加入，也可以通過一個(gè)共培養(yǎng)裝置由組織直接分泌出來。
高內(nèi)涵成像可以進(jìn)行可視化血管生長結(jié)構(gòu)、三維重構(gòu)，并能進(jìn)行血管生成和新血管萌發(fā)相關(guān)的復(fù)雜分析。在這里，我們描述了一種可獲得血管生成相關(guān)的多維量化結(jié)果的成像分析方法，以用于疾病表型和復(fù)合效應(yīng)的比較研究。

方法
細(xì)胞模型
3D 血管生成模型是在 MIMETAS OrganoPlate 3-lane3,4細(xì)胞芯片板上構(gòu)建而成。OrganoPlate 3-lane 板是基于 384 孔板上設(shè)計(jì)而成的，每個(gè)微流控單元由 3x3 個(gè)孔組合而成，整板共 40 個(gè)單元 ( 圖 1 )。每一個(gè)微流控單元包含了三個(gè)泳道。膠原 -I 細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 膠被填埋入中間的泳道內(nèi)。被稱為“ 相導(dǎo) ”(phaseguides) 的小型壓力屏障將 ECM 凝膠定型，防止其流入鄰近的灌注泳道。接著，將內(nèi)皮細(xì)胞 ( 原代細(xì)胞系，iPSC 誘導(dǎo) ) 種到灌注泳道上方，并附著于 ECM 膠上。灌注開始時(shí)將OrganoPlate 放置在搖床上，當(dāng)細(xì)胞增殖時(shí)，它們形成內(nèi)皮微血管。在血管形成后，在母體內(nèi)皮血管的另一側(cè)的底部灌注泳道中加入一系列促血管生成因子。由此產(chǎn)生的血管生成的化合物梯度會(huì)誘導(dǎo)血管生成芽。血管新生芽培養(yǎng) 0-4 天，然后固定，并進(jìn)行定量分析比對。可以在附錄中找到三維血管生成模型的示意圖。

成像
血管細(xì) 胞 和芽用 4% 甲醛固定，用抗 VE-cadherin 的一抗結(jié)合樣本，再用二抗 Alexa488 ( 綠色 ) 進(jìn)行染色標(biāo)記。肌動(dòng)蛋白絲用 ActinRed ? ReadyProbes ?試劑( 紅色 ) 染色，細(xì)胞核用 Hoechst ( 藍(lán)色 ) 染色。細(xì)胞用ImageXpress Micro 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng) (Molecular Devices) 進(jìn)行成像。細(xì)胞圖像使用共聚焦模式 ( 60 μmpinhole 轉(zhuǎn)盤 )，在 10x 或 20x 水鏡下進(jìn)行成像。20x 成像中，采 集了45-58 層的 z-stack 圖層圖像，每層 2-4μm 間距。對于 10x 物鏡，采集了 15-25 層圖層，每層4-6 μm 間距。細(xì)胞核用 DAPI 通道，血管生成的芽用FITC 通道，分別在 100 ms 和 400 ms 曝光時(shí)間下采集圖像。
圖像分析
圖像分析使用了 MetaXpress 高內(nèi)涵成像分析軟件中的 Custom Module Editor 客制化分析功能。細(xì)節(jié)在結(jié)果部分 做了詳細(xì)描述。簡單來說，使 用了 Neurite Outgrowth 模塊對延伸的血管芽進(jìn)行識(shí)別，使用 Count Nuclei 模塊進(jìn)行細(xì)胞核表征。然后用“ Z佳匹配連接 ”功能將物體在三維空間的 z 平面之間進(jìn)行連接。二次分析則是在 Excel 軟件中完成的。使用 MetaXpress 軟件中的 3D 自定義模塊分析圖像。分析方法的展示需要用到 Custom Module Editor (CME) 和
3D 圖像分析能力。自定義模塊包含了幾個(gè)步驟，首先用Neurite Outgrowth 模塊識(shí)別出每張圖中的血管芽，處于 3D 空間中不同 Z 層面的物體利用“ Z佳匹配連接 ”選項(xiàng)進(jìn)行三維拼接。隨后血管芽的數(shù)量，以及它們的體積和熒光強(qiáng)度值都能在分析中獲得。細(xì)胞核的計(jì)數(shù)是可選項(xiàng)，無論是每張圖的總細(xì)胞核數(shù)量，還是每個(gè)芽的細(xì)胞核數(shù)量都可以被定量。在分析過程中使用的感興趣區(qū)域圖層只包括位于凝膠泳道內(nèi)的物體，而不包括內(nèi)皮細(xì)胞管通道內(nèi)的物體。用這種方法可以只計(jì)算血管生成芽，而不計(jì)算上泳道的細(xì)胞。所開發(fā)出的自定義分析模塊在20x 和 10x 圖像中都可以應(yīng)用?；蛘撸瑘D像分析也可以在2D Z大值投影圖像上進(jìn)行分析。對于芽的長度評價(jià)，略有不同的是，在 CME 中使用“Fibers”應(yīng)用模塊來進(jìn)行分析 ( 未顯示 )。

結(jié)果
時(shí)間依賴的血管生成過程模型在 OrganoPlate 3-lane 中進(jìn)行建模。血管內(nèi)皮細(xì)胞被種于上泳道中，三天左右形成血管。該模型包括內(nèi)皮細(xì)胞在上層泳道或同時(shí)在上層和底層泳道中生成的血管，或者在中間的膠原蛋白膠質(zhì)層 ( 圖 1 )。底部泳道添加生長因子可以促進(jìn)在膠原蛋白中生成血管新生芽，并能進(jìn)行成像和分析 ( 圖 2 )。
如圖二所示，圖像以 10x 或 20x 進(jìn)行展示。使用一顆20x 水鏡成像時(shí)，可以看到細(xì)胞在固體基質(zhì)中非常銳利和高分辨率的圖像。用 10x 物鏡成像雖然少了部分細(xì)節(jié)，但是拍攝速度會(huì)更快，因?yàn)槊總€(gè)孔只需要拍攝一個(gè)視野和更少的圖層數(shù)量。更重要的是，感興趣區(qū)域可以將原有血管和新生血管有效區(qū)分開來。血管新生芽的代表性圖像如圖 2 所示。

圖 2 器官芯片板中血管生成芽的圖像。培養(yǎng) 1 天和 4 天后形成的新生芽的Z大投影圖像。注意圖像上部的管狀血管細(xì)胞。血管新生芽從上管進(jìn)入含有膠原蛋白的泳道，向含有生長因子的下線延伸。核染色 (Hoechst) 為藍(lán)色，VE-cadherin 為綠色，肌動(dòng)蛋白為紅色。

圖 3 A. 成像原圖及使用 CME 編輯后的圖層。利用 Neurite Outgrowth 模塊在每層 z-image 中識(shí)別出單個(gè)的芽和核，然后利用“ Z佳匹配連接 ”函數(shù)將每個(gè)圖像中的對象進(jìn)行三維連接。該分析能夠識(shí)別芽的總數(shù)量，總體積，平均強(qiáng)度，以及核計(jì)數(shù)。B. 用 MetaXpress軟件實(shí)現(xiàn)血管生成芽的三維可視化。C. 每幅圖像中的對象通過“ Z佳匹配連接 ”功能進(jìn)行三維連接。分離的芽和核顯示為假色。D. 使用“Find Nuclei”模塊對每幅圖像中的細(xì)胞核進(jìn)行識(shí)別，然后使用“connect by touching”選項(xiàng)對目標(biāo)進(jìn)行連接。

圖 3 描述了使用“ Z佳匹配連接 ”功能進(jìn)行圖像分析的過程，包括平面分割和三維特征連接。觀察到芽的數(shù)量和體積隨時(shí)間而增加，細(xì)胞或核的數(shù)量也在增加 ( 圖 4-5 )。
整塊板的圖像分析自動(dòng)執(zhí)行，無需用戶干預(yù)。如果染色強(qiáng)度顯著不同，可能需要在實(shí)驗(yàn)之間額外調(diào)整圖像強(qiáng)度閾值。另外使用 Power Core 軟件對分析也是必要的。圖 6 演示了自定義模塊編輯 (CME) 用于分析的工作流程。

圖 4 隨著時(shí)間的推移，器官芯片板內(nèi)的血管新生萌發(fā) (RFP- HUVECs)。從左至右，在底部泳道用血管生成混合物分別刺激 0、1、2、3、4天，形成血管生成芽。樣本染色為肌動(dòng)蛋白 ( 紅色 ) 和 VE-cadherin ( 綠色 )。用 Hoechst 染核。

圖 5 血管生成的定量評估。例如連續(xù)四天在 3D 膠原蛋白中的血管新生芽生長狀況。柱狀圖顯示了血管生成芽的定量測量。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次，誤差條代表 STDEV。

圖 6 Customer Module Editor。展示自定義模塊編輯器的分析步驟。
結(jié)論
從血管生成等復(fù)雜生物過程的表型變化中獲得定量數(shù)據(jù)具有非常重要的意義。三維生物模型提供了一個(gè)更好的代表復(fù)雜
人類生物學(xué)的方法，而復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)的圖像分析是具有挑戰(zhàn)性的。
我們開發(fā)和優(yōu)化了一套完整的成像和分析方案，能夠在 MIMETAS 平臺(tái)上進(jìn)行血管生成芽的拍攝、可視化及定量分析。
成像方案是基于 ImageXpress Micro 共聚焦系統(tǒng)和 MetaXpress 軟件開發(fā)的，以提供成像和分析的集成式工作流程。
將該系統(tǒng)與可擴(kuò)展的器官芯片平臺(tái)的功能相結(jié)合，為疾病建模和化合物篩選解鎖新的表型效應(yīng)的定量表征。