簡(jiǎn)介
在制藥和醫(yī)療器械生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)污染物樣品的監(jiān)測(cè)是一個(gè)關(guān)鍵步驟。內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中，是一種常見(jiàn)的污染物，可引起發(fā)燒、炎癥、頭痛、惡心，甚至死亡。內(nèi)毒素的常規(guī)檢測(cè)方法是鱟試劑溶酶法 (LAL)，核心成分是鱟的血液中提取而來(lái)。在內(nèi)毒素存在的情況下，LAL通過(guò)酶促級(jí)聯(lián)凝固，可以通過(guò)比濁法或顯色法定量 ( 圖 1A )。這些方法涉及多個(gè)酶的步驟，并取決于鱟的可用性。龍沙公司生產(chǎn)的 PyroGene 重組因子 C 試劑盒 (rFC) 提供一種定量檢測(cè)的方法，通過(guò)一步酶促反應(yīng)，不借助于動(dòng)物衍生產(chǎn)品，與 LAL 方法具有相同的靈敏度。在內(nèi)毒素存在的情況下，活化的 rFC 會(huì)裂解熒光基質(zhì)，導(dǎo)致熒光信號(hào)的增加 ( 圖 1B )，這與內(nèi)毒素的含量成正比。

材料
? PyroGene 重組因子 C 終點(diǎn)法熒光檢測(cè)試劑盒 (Lonza cat. #50-658U)
? LAL Reagent Grade? Multi-well Plates (Lonza cat. #25-340)
? Pyrogen-free Dilution Tubes Lonza cat. #N207)
? LAL Reagent Water (Lonza cat. #W50-640)
? SpectraMax i3 或 i3x 多功能微孔板讀板機(jī) ( Molecular Devices 公司其它支持熒光檢測(cè)的微孔板讀板機(jī)均可以使用 )
? SoftMax Pro 軟件 (Molecular Devices)

優(yōu)勢(shì)
? 一步酶促反應(yīng)以及非動(dòng)物衍生產(chǎn)品特點(diǎn)完成檢測(cè)，可確保樣本的安全性
? 利用 SpectraMax 系列微孔板讀板機(jī)可獲得更高的靈敏度
? SoftMax Pro 軟件的 Workflow方式進(jìn)行讀取-孵育-讀取的自動(dòng)化流程節(jié)省了大量時(shí)間

方法
用試劑盒提供的凍干的 E. coli O55:B5 內(nèi)毒素按照瓶上 LAL 試劑水的體積進(jìn)行配置，得到 20 EU/mL 的原液。將配置好的原液高速震蕩混勻 15 分鐘，用旋渦攪拌器使其完全溶解。用 LAL 試劑水稀釋原液，每次稀釋時(shí)用力搖勻，制得濃度標(biāo)準(zhǔn):5 EU/mL、0.5 EU/mL、0.05 EU/mL、0.005 EU/mL、0.001 EU/mL。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后 PyroGene 試劑盒檢測(cè)的線(xiàn)性范圍為0.005 EU/mL 至 5.0 EU/mL，增加了額外的標(biāo)準(zhǔn)品濃度 (0.001 EU/mL)，以測(cè)試SpectraMax i3 讀板機(jī)的靈敏度。
讀板機(jī)的溫度設(shè)置在 37℃，在實(shí)驗(yàn)前等待其內(nèi)部溫度升至 37℃。取 100 μL 空白對(duì)照和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 ( 3 復(fù)孔 ) 加入到微孔板的孔中。該微孔板放置在讀板機(jī)內(nèi) 37℃ 孵育至少 10 min。在預(yù)孵育過(guò)程中，分別以 5:4:1 的比例將熒光基質(zhì)、檢測(cè)緩沖液和 rFC 酶溶液混合制備工作液。在預(yù)孵育 10 分鐘后取 100μL 工作液添加到每個(gè)孔。
SpectraMax i3 讀板機(jī)的溫度在實(shí)驗(yàn)期間維持在 37℃。使用表一中顯示的設(shè)置在 0時(shí)刻讀板 ( 加入工作液后 )。在 SoftMaxPro 軟件中設(shè)置 PMT 增益值為自動(dòng)獲取，可以確保在不需要確定靈敏度設(shè)置的情況下，在整個(gè)樣本范圍內(nèi)獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。初始進(jìn)行板高優(yōu)化，優(yōu)化后的 2 mm 讀高用于后續(xù)檢測(cè)。在first讀數(shù) (T0) 后,微孔板在讀板機(jī)內(nèi)37℃ 孵育 1 小時(shí)，然后用同樣的設(shè)置讀取第 2 次。讀取-孵育-讀取的工作流程可以在SoftMax Pro 軟件設(shè)置自動(dòng)讀取 ( 圖 2 )。在第二次讀數(shù)后 (T60), 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品使用以下算法計(jì)算 ΔRFU：(STDT60-STDT0) ?(BLT60-BLT0)
? STDT60 是 1 小時(shí)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的 RFU
? STDT0 是 0 時(shí)刻時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的 RFU
? BLT60 是 1 小時(shí)時(shí)空白對(duì)照的 RFU
? BLT0 是 0 時(shí)刻時(shí)空白對(duì)照的 RFU

結(jié)果
SpectraMax i3 讀板機(jī)滿(mǎn)足 PyroGene 試劑盒的各種要求，使用 ΔRFU 的 log 值和濃度的 log 值在 SoftMax Pro 軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) ( 圖 3 )采用五個(gè)梯度的內(nèi)毒素稀釋液 ( 濃度從0.001 EU/mL 到 5 EU/mL ) 進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)的 CV 低于 5%。R2 值為 0.996，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在這一擴(kuò)展的濃度范圍內(nèi)顯示出良好的線(xiàn)性。SpectraMax i3 讀板機(jī)能夠檢測(cè)到比產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中建議的范圍 ( 0.005EU/mL 到 5.0 EU/mL ) 更低的內(nèi)毒素濃度，顯示其具有更高的熒光檢測(cè)靈敏度。
總結(jié)
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在低濃度復(fù)孔間的變異很小，而且靈敏度低于建議的檢測(cè)下限，展現(xiàn)了SpectraMax i3 多功能讀板機(jī)在進(jìn)行
GyroGene 重組因子 C 檢測(cè)時(shí)具有非常優(yōu)異性能優(yōu)勢(shì)。用 SpectraMax i3x 讀板機(jī)和其他熒光檢測(cè)的 SpectraMax 讀板機(jī)也可以得到類(lèi)似的結(jié)果。
SoftMax Pro 軟件可用于分析數(shù)據(jù)，ΔRFU值用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算生成 R2，并顯示出該讀板機(jī)在低濃度內(nèi)毒素檢測(cè)的靈敏度。