背景介紹
近年來(lái)，將體外腫瘤細(xì)胞聚集物作為模擬體內(nèi)組織環(huán)境模型的技術(shù)得到了重大的突破。該項(xiàng)技術(shù)能夠使種植在低吸附圓
底孔板中離散的細(xì)胞聚集成球體。而球體被認(rèn)為能夠比常規(guī)的二維 (2D) 細(xì)胞培養(yǎng)更有效地模擬腫瘤行為。因?yàn)榕c腫瘤實(shí)
體類似，3D 細(xì)胞球也包含暴露在球面的細(xì)胞和深埋在球內(nèi)的細(xì)胞、都含有增殖和非增殖的細(xì)胞，并且球體中心是一個(gè)缺氧環(huán)境。越來(lái)越多的實(shí)例已成功地將這種三維球體模型用于各種用途的化合物篩選，以研究潛在的癌癥療法。然而要獲得這類 3D 球體分析的可靠方法時(shí)，是具有挑戰(zhàn)性的：
? 定位聚焦在一個(gè)視野中即可看到完整的球體，以便對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行批量成像。
? 優(yōu)化化合物和染色處理，確保染料滲透效果，避免干擾球體的位置。
? 在整個(gè) 3D 結(jié)構(gòu)中獲取具有代表性的圖像，Z大限度地減少成像平面上下的失焦和背景信號(hào)。
? 快速分析圖像以產(chǎn)生有意義的結(jié)果，從中可以得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

主要特點(diǎn)
? 在 20 倍物鏡下只需要一個(gè)視野即可獲得完整的球體。
? 支持在 96 孔板或者 33D 成球?qū)嶒?yàn)。

? 使用共聚焦成像精確檢測(cè)細(xì)胞反應(yīng)。

? 可通過(guò)只保存 z 平面圖像的 2D 投影來(lái)節(jié)省存儲(chǔ)空84 孔板中進(jìn)行 間。

球體形成和處理
我們使用下面的方法來(lái)對(duì)腫瘤細(xì)胞系 HCT116,DU145 和HepG2 進(jìn)行細(xì)胞成球。在 37℃ 和 5%CO2 條件下，細(xì)胞在培
養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。然后消化，并使用含有適當(dāng)濃度胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后以每孔 1000-1500 個(gè)細(xì)胞的濃度將細(xì)胞懸液鋪設(shè)在 96 孔或 384 孔 U 型底的黑邊底透板中，可使用 Corning 4520 和 3830 兩種型號(hào)的板材。培養(yǎng) 24 小時(shí)后，每孔底部細(xì)胞開(kāi)始形成單一的球體。繼續(xù)在 37℃ 和 5%CO2 條件下連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞 2-4 天，直至細(xì)胞球尺寸符合實(shí)驗(yàn)要求 ( 圖 1 )。球體可以培養(yǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間，但球體過(guò)大會(huì)阻礙染色滲透，以致Z中心細(xì)胞無(wú)法成像。
本應(yīng)用手冊(cè)描述了用于測(cè)定anticancer化合物 ( 依托泊苷、紫杉醇和絲裂霉素 C ) 效果的分析方法。球體處理過(guò)程首先在孔中加入濃度為 10 倍的化合物，然后孵育 1-4 天，這取決于所研究的藥物作用機(jī)理。較短的藥物作用時(shí)間用于研究細(xì)胞凋亡，較長(zhǎng)的藥物作用時(shí)間用于多參數(shù)細(xì)胞毒性研究。對(duì)于超過(guò) 2 天的藥物處理，化合物以 1 倍濃度每 2 天更換一次。

球體染色和成像
這里舉例來(lái)源于優(yōu)化的 HCT116 球體分析，該方法用于評(píng)估球體形態(tài)變化以及球中凋亡細(xì)胞的發(fā)生率。在完成藥物化合
物處理過(guò)程后，所有染料混合在一起，以 4-6 倍濃度的條件直接加入到每孔中進(jìn)行染色。染料無(wú)需洗滌過(guò)程，以避免對(duì)細(xì)胞球的位置和完整度的影響。
使用 ImageXpress 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)的 10 倍或 20 倍物鏡對(duì)球體進(jìn)行成像。為了分析細(xì)胞在整個(gè)三維結(jié)構(gòu)中的反應(yīng)，我們從球體內(nèi)部不同 Z 軸深度收集圖像，以創(chuàng)建一個(gè)“stack”圖像。然后使用數(shù)學(xué)算法將這些圖像組合或“ 堆
疊 ”成一個(gè)二維投影圖像。該算法使 stack 中每一層圖像中亮度Z高的像素保持在生成投影的圖像中 ( 圖 2 )。

ImageXpress 共聚焦成像系統(tǒng)可生成更清晰的圖像，以實(shí)現(xiàn)更精確的 Z 軸分割
在對(duì)球體進(jìn)行 Z 軸成像方面，共聚焦成像比寬場(chǎng)成像提供了更薄的 Z 軸切層。這大大減少了被采集平面上方和下方熒光
發(fā)射物體產(chǎn)生的背景干擾而產(chǎn)生的光暈效果。它還提供亞細(xì)胞水平或細(xì)胞之間的精細(xì)細(xì)節(jié)的更好分辨率。使用共聚焦成
像通常可以實(shí)現(xiàn)更精確的分割。在對(duì)球體的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，從寬場(chǎng)圖像中分割出的細(xì)胞核數(shù)量比共聚焦圖像中的細(xì)胞核數(shù)量低約 20% ( 圖 3 )。

圖 1 在高通量篩選環(huán)境中測(cè)試球體的工作。 [ 單個(gè)球體可以在96 孔或 384 孔的平板上生長(zhǎng)，用化合物處理，然后用混合染料染色，這種染料可以不用水洗就可以成像。如果需要，也可以固定球體。( 右 ) 使用 ImageXpress 顯微共聚焦系統(tǒng)上的延時(shí)成像功能在 63 小時(shí)內(nèi)拍攝了 HCT116 細(xì)胞的透射光圖像，以顯示球體 (10 倍物鏡 ) 的形成。]

圖 2 在 z 平面上獲得了一組共聚焦圖像，其跨度約為球體深度的一半( 左 )。 在任何一層 Z 軸圖像上，只有球體的部分細(xì)胞是聚焦的，因此為了便于分析，圖像被堆疊成一個(gè)二維圖像，以合并聚焦區(qū)域 ( 右 )。

圖 3 ( 上圖 ) 用寬場(chǎng)系統(tǒng)拍攝的 15 幅 HCT116 球體圖像的Z佳聚焦投影。 軟件分割計(jì)算出 817 個(gè)核。由于球體邊緣的未聚焦熒光和中心的弱細(xì)胞導(dǎo)致畸變，細(xì)胞核丟失。( 下圖 ) 用共聚焦系統(tǒng)拍攝的 HCT116 球體的 15 幅圖像的Z佳聚焦投影。更精確的數(shù)字是 1078 個(gè)核。
細(xì)胞凋亡法篩選anticancer藥物
有一類anticancer藥物以外源性凋亡途徑為靶點(diǎn)，引發(fā)細(xì)胞死亡。為了證明細(xì)胞凋亡檢測(cè)的有效性，HCT116 球體在 96 孔板中培養(yǎng) 3 天，用 4 種不同anticancer化合物的梯度稀釋溶液處理24-48 小時(shí)。在化合物處理結(jié)果后，用 Life 公司的 CellEvent Caspase 和 MitoTracker 橙色試劑染色來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。染色過(guò)程是將所有染料混合在一起，以 4-6 倍濃度的條件直接加入到每孔中進(jìn)行染色，其中包含 Hoechst 核染色試劑。染料無(wú)需洗滌過(guò)程，以避免對(duì)細(xì)胞球的位置和完整度的影響 ( 圖 4 )。

圖 4 ( 上圖 ) HCT116 球體圖像批量成像每孔的縮略圖，在 96 孔板上用化合物處理，用 10 倍物鏡成像。 Hoechst 染色的細(xì)胞核 ( 藍(lán)色 ) 上覆有細(xì)胞事件 caspase3/7 凋亡標(biāo)記物 ( 綠色 )。未經(jīng)處理的對(duì)照樣本在第 4 列中。在第 5-7 列中，caspase3/7 信號(hào)明顯，其中紫杉醇從 a 行的 1μM 連續(xù)按照 1:3 的稀釋比例進(jìn)行稀釋 ( 重復(fù) 3 次 )。( 左 ) 將 11 個(gè) z 平面組合成二維Z大投影圖像，并用一個(gè)簡(jiǎn)單的定制模塊進(jìn)行分析。原始圖像顯示低和高程度的凋亡及其相應(yīng)的分割掩模 ( royal blue = 細(xì)胞核，粉紅色 = 凋亡細(xì)胞 )。( 右圖 ) 通過(guò)將凋亡量與未經(jīng)處理的球體相比標(biāo)準(zhǔn)化并繪制在圖表上，可以看出紫杉醇 ( 綠線 ) 誘導(dǎo)凋亡的濃度遠(yuǎn)低于絲裂霉素 C 或足葉乙甙。

圖 5 抗霉素 A 對(duì)線粒體的毒性作用。 ( 左 ) Hoechst ( 藍(lán)色 ) 和 MitoTracker ( 橙色 ) 圖像的疊加，圖中球體經(jīng)抗霉素 A 處理，濃度依次遞增為 1、22、67 和 200 nM。( 右圖 ) 球體內(nèi)線粒體的平均強(qiáng)度值顯示了藥物的作用。
線粒體膜電位的多重篩選分析
在上面的細(xì)胞凋亡篩選中，線粒體膜電位也可以做為篩選條件進(jìn)行多參數(shù)的評(píng)估。通過(guò)向染料混合物中添加MitoTracker
橙色，即可對(duì)球體進(jìn)行線粒體膜電位進(jìn)行評(píng)估。另外，通過(guò)影響線粒體代謝來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物也可以使用該方法來(lái)進(jìn)行研究。下面展示了一種對(duì)抗霉素 A 的篩選方法?？姑顾谹 是線粒體膜電位的potent干擾劑。經(jīng)過(guò) 4 小時(shí)的藥物處理后，根據(jù)球體細(xì)胞內(nèi)的橙色的強(qiáng)度，可以檢測(cè)到線粒體的健康狀況。如圖 5 所示，MitoTracker 球體內(nèi)部的線粒體信號(hào)很弱，要么沒(méi)有完全穿透到大球體的中心，要么中心的細(xì)胞沒(méi)有健康的線粒體。

微板中三維球體的快速篩選
三維細(xì)胞球的培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大小一致的人癌細(xì)胞球體，并且能夠使用自動(dòng)化的高通量、高內(nèi)涵成像技術(shù)篩選藥物處理后
的球體反應(yīng)，這是篩選化療藥物候選物相關(guān)測(cè)試的重要一步。ImageXpress 共聚焦系統(tǒng)和 MetaXpress 軟件允許快速成像和分析微板中的 3D 球體，以監(jiān)測(cè)anticancer藥物誘導(dǎo)的凋亡和線粒體毒性，來(lái)進(jìn)行候選藥物的篩選。有關(guān)優(yōu)化這些球體篩選分析的采集參數(shù)的更多信息，請(qǐng)參閱論文：Sirenko, O. et al.,High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay and Drug Development Technologies, 2015。