介紹
自 20 世紀 60 年代發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白以來，各種熒光蛋白(FP) 及其變體已被開發(fā)出來，跨越整個可見光譜。這些基因編碼的熒光蛋白在細胞生物學領域引發(fā)了一場革命。藍綠色熒光蛋白 (CFP) 因其在 FRET 等多色領域的應用而受到廣泛關注。這是因為 CFP 的激發(fā)和發(fā)射光的波長范圍很少使用，反而使得它成為各種熒光基團的多路復用的理想化選擇。

熒光蛋白技術和自動顯微鏡技術的發(fā)展使研究人員能夠更深入地研究活細胞中的基因功能和動態(tài)過程。熒光蛋白常被用作融合到感興趣基因上的報告基因。一旦 FP 標記的基因產(chǎn)物被細胞成功表達，就可以對其進行成像，以研究蛋白質、細胞器和細胞間隔的功能并跟蹤其定位。1FP 融合產(chǎn)物的直接可視化還有助于優(yōu)化細胞中表達新遺傳物質的方法。轉染和轉導是將核酸和蛋白質引入細胞的兩種常用方法。然而每一種方法都需要詳細的計劃和優(yōu)化時間，它們都受到基因材料導入和細胞表達效率的限制。這些因素需要使用穩(wěn)健和精確的方法來評估轉導或轉染效率。

優(yōu)勢
? 在 CFP 波長范圍內使用熒光基團進行多色應用
? 明場成像的細胞分析
? 使用預配置的分析模塊進行轉導效率的定量分析
? 通過即時分析（on-the-fly）在獲取圖像的同時生成數(shù)據(jù)

在本文中，我們強調了 ImageXpress Pico 自動化細胞成像分析系統(tǒng)和 CellReporterXpress圖像采集和分析軟件的效用，通過評估轉導效率來優(yōu)化載體濃度。我們使用 CellLight ? Nucleus-CFP, BacMam 轉導試劑瞬時轉導兩個細胞系，該試劑利用 BacMam 載體系統(tǒng)傳遞遺傳物質。在這篇應用文章中我們闡述了在 ImageXpress Pico 上使用明場和 CFP 熒光通道獲取圖像，以及使用CellReporterXpress 軟件進行轉導效率分析。據(jù)此我們重點展示了 CFP 通道在多色成像方面的實用價值。

材料
? ImageXpress Pico 自動化細胞成像分析系統(tǒng) (Molecular Devices)
? CellReporterXpress 圖像獲取和分析軟件 (Molecular Devices)
? HeLa 細胞 (ATCC, P/N: CCL-2)
? U2OS 細胞 (ATCC, P/N: HTB-96)
? 96- 孔微孔板 (Greiner, cat #: 655090)
? CellLight Nucleus-CFP BacMam 2.0 (ThermoFisher, cat #: C10616)
? MitoTracker Deep Red FM (ThermoFisher, cat #:M22426)
? AlexaFluor 546 Phalloidin (ThermoFisher, cat #:A22283)

方法
利用 BacMam 轉導試劑轉導 HeLa 和 U2OS細胞
使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)進行轉導分析的工作流程如圖 1 所示。將 HeLa 和 U2OS 細胞鋪在 96 孔的底透微孔板中，每孔 8000 個細胞。細胞在 37℃ , 5% CO2 下孵育過夜。將 CellLight Nucleus-CFP、BacMam 2.0 (BacMam
Nucleus-CFP) 分別以 25、50、75 和 100 顆粒 / 細胞 (PPC)的濃度加入孔中。該試劑由 BacMam 的主體架構組成，包含融合到 CFP 的 SV40 核定位序列。每個 PPC 濃度處理重復三次，用轉導試劑在 37℃，5% CO2 下培養(yǎng) 19 小時。
在成像之前，將培養(yǎng)基和 BacMam Nucleus-CFP 從孔中取出，用活細胞成像培養(yǎng)基替代。

無標記和熒光成像
使用帶有明場和 CFP 熒光通道的 ImageXpress Pico系統(tǒng)在 10X 物鏡下成像。通道的曝光時間為 3 ms （ 明場 ）和 1000 ms (CFP)。每孔成像 9 個 位點，占全孔的47.52%。為進行明場分析，對成像設置進行了優(yōu)化，方法是對明場圖像進行輕微的離焦，以增強對比度 ( 圖 2 和圖3 )。
多種熒光染料進行染色
在 4% 多聚甲醛固定細胞前，用 MitoTracker Deep Red染 色 30 min, PBS 洗滌 1 次。固定后，細胞經(jīng)沖洗、堵塞、滲透，然后用 AlexaFluor 546 Phalloidin 染色。然后用 PBS 洗滌細胞兩次，然后用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)用40X 物鏡和 CFP、TRITC 和 Cy5 通道成像。
轉導效率的自動化圖像分析
在成像過程中，使用 CellReporterXpress 中的透射光細胞分類的通用分析模塊對 HeLa 和 U2OS 細胞進行即時分析（on-the-fly），以量化分析轉導效率。在用戶干預Z少的情況下，使用相應的分析模塊對明場成像細胞圖片進行量化分析，然后對細胞的 CFP 表達進行陽性或陰性評分。稍微離焦的明場圖像為分析提供了Z佳對比度，如圖3 所示，該分析能夠準確地計數(shù)低對比度、薄層的 U2OS細胞。從分析中產(chǎn)生多參數(shù)結果，并提供了轉導實驗結果的綜合視圖 ( 圖 4A )。這些讀數(shù)包括了初單個細胞之外的綜合測量結果，如陽性和陰性細胞計數(shù)和百分比，以及所有細胞和陽性細胞面積和強度。

圖 1 CellLight, BacMam 轉導效率檢測的工作流程與 ImageXpress Pico 系統(tǒng)和 CellReporterXpress 軟件。 U2OS 和 HeLa 細胞與 BacMam 試劑以不同的每細胞顆粒濃度 (PPC) 孵育 19 小時。使用 10X 物鏡捕獲圖像，并即時運行（on-the-fly）透射光細胞分類分析模塊。

結果
HeLa 和 U2OS 細胞轉導效率的比較
分析結果表明，增加 BacMam Nucleus-CFP 的 PPC 濃度，轉導效率相應增加，U2OS 細胞表現(xiàn)出對 BacMam 轉導系統(tǒng)更大的敏感性（ 圖 4 ）。在 25 至 50 PPC 濃度之間處理的兩種細胞類型中可觀察到Z顯著的轉導效率增加，但這一趨勢在 Hela 細胞上表現(xiàn)的更明顯。盡管 50 和 75 PPC 濃度處理的 HeLa 細胞沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異，但 100PPC 可使 HeLa 細胞轉導效率提高約 10%。對于 U2OS 細胞，這種轉導效率的增加在 50、75 和100 個 PPC 處理之間沒有顯著差異（ 圖 4B ）。每個 PPC 濃度在 U2OS 細胞中產(chǎn)生 90% 或更高的轉導效率。
同樣，CFP-SV40 核定位序列的整體表達也隨著 PPC 濃度的增加而增加。這是通過測量正向轉導細胞的 CFP 強度來評估的（ 圖4C）。單個細胞數(shù)據(jù)也同樣驗證了 Hela 和 U2OS 細胞 CFP 強度的Z高水平。具有較小面積和圓形的外觀被識別為目標細胞（ 圖 5）。這種圓形的細胞形態(tài)學的特點是細胞進行分裂，但進行活性染色、增殖或細胞周期標記的證明也是必要的。此外通過自動化細胞顯微成像觀察 CFP-SV40 融合，可以發(fā)現(xiàn)插入的嵌合蛋白的定位。隨著 CFP 表達的增加，我們注意到SV40 蛋白的胞質定位增加，如圖 5C 所示。這表明，PPC 的Z佳濃度與Z高的轉導效率或導入基因物質的Z佳表達和定位之間存在平衡。這些高轉導效率和固定后 CFP 信號的持久性進一步證明了這種 BacMam 試劑在活細胞成像和終點法，以及固定細胞染色方面的實用價值。此外使用 ImageXpress Pico 成像 CFP標記核的能力解放了其他更常用的通道，從而可以成像其他熒光團染色的細胞結構（ 圖 6 ）。

圖 2 添加 CellLight Nucleus-CFP, BacMam 19 小時后 HeLa 細胞的代表性 10X 圖像。（ 左 ）圖像來自經(jīng)過 50 PPC 或 100 PPC 處理的孔。與未被轉導的細胞 ( 僅明場圖像 ) 相比，被轉導的 HeLa 細胞（ 明場和CFP ）可以被清晰地觀察到。（ 右 ）利用 CellReporterXpress 軟件中的通用模塊透射光細胞分類，根據(jù) CFP 的表達對細胞進行陽性（ 綠色 ）或陰性的轉導評分。

圖 3 添加 CellLight Nucleus-CFP、BacMam 后 19 小時 U2OS 細胞的代表性 10X 圖像。（ 左 ）圖像來自經(jīng)過 50 PPC 或 100 PPC 處理的孔。轉導的 U2OS 細胞（ 明場和 CFP ）可以清晰地顯示出來。（ 右 ）透射光細胞分類模塊 (transmission Light Cell score) 是 CellReportXpress軟件中的通用模塊，用于對陽性細胞（ 綠色 ）或陰性細胞（ 紅色 ）進行轉導分類。

圖 4 不同濃度的 CellLight Nucleus-CFP、BacMam 處理 HeLa 和 U2OS 細胞的轉導效率結果的比較。 (A) 從轉導效率分析中產(chǎn)生的多參數(shù)結果，并將測量結果顯示在互動數(shù)據(jù)表上，只需輕輕一點，便可輕松導出為 CSV 文件。以熱圖形式展現(xiàn)陽性細胞率（ 百分比 %，轉導結果為陽性的細胞 ）和陽性細胞的平均面積，并使用陽性細胞的百分率對數(shù)據(jù)表進行排序——在表的頂部出現(xiàn)了 % 陽性細胞Z多的孔。這一數(shù)據(jù)表明，U2OS 比 HeLa 細胞更容易轉導，這是來自于對 (B) 轉導陽性細胞百分比和 (C) 陽性細胞 CFP 熒光強度的分析。

圖 6 U2OS 細胞的多重染色突出了 CFP 通道在與其它的熒光團進行多路復用時的效用。 用 (A) 75 PPC 的 BacMam Nucleus- CFP 試劑（ 細胞核，青綠色 ）轉導 U2OS 細胞，然后用 (B) MitoTracker Deep Red （ 線粒體、紅色 ）和 (C) AlexaFluor 546 Phalloidin（ 肌動蛋白、黃色 ）染色后轉導 U2OS 細胞。(D) 合并后的三通道 (CFP、TRITC、Cy5) 疊加效果如圖中所示。
結論
BacMam 試劑有效地轉導了 HeLa 和 U2OS 細胞，并為活細胞成像應用提供了一個更常用合適的核染色替代試劑。我們展示了 ImageXpress Pico 系統(tǒng)和 CellReporterXpress 軟件在核轉導評估和定量中的應用。ImageXpress Pico 系統(tǒng)具有強大的聚焦性能、預配置的分析模塊和數(shù)據(jù)報告，是評估和優(yōu)化轉導 / 轉染檢測的一個完整工具。此外對 CFP 熒光成像的能力為其它更常用的熒光蛋白（ 如 GFP）提供了一個合適的替代方案，使得在進行細胞標記或細胞結構成像時具有更豐富的熒光通道選擇。