介紹
對環(huán)境中未經(jīng)檢驗的化學(xué)品日益普遍的關(guān)注已經(jīng)產(chǎn)生了開發(fā)可靠和有效的篩選工具以識別可能影響人類健康的1，特別是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)的迫切需求。我們評估了一種神經(jīng)突向外生長的測定方法，通過篩選和表征所選化合物的活性，評估其是否可能對發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。選擇該測定法是因為其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵過程的模型具有一定相關(guān)性，特別是神經(jīng)元會通過延伸其神經(jīng)突以形成完整的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)2。破壞這一過程可能會對人類和嚙齒動物產(chǎn)生不利影響，因此研究表明，未成熟、發(fā)育中和成熟的神經(jīng)突是化學(xué)毒性的靶標(biāo)3。
雖然神經(jīng)突向外生長測定主要用于評估發(fā)育神經(jīng)毒性，但也可用于評估通過檢測神經(jīng)突收縮的神經(jīng)變性。此外，該測定還有可能與評估成年神經(jīng)元中的神經(jīng)可塑性相關(guān)4。對于篩選測定，總神經(jīng)突向外生長通常是指標(biāo)報告中Z常見的度量標(biāo)準(zhǔn)1,5。利用自動成像還能夠?qū)ζ渌卣鬟M行多參數(shù)評估，例如總分支數(shù)和總過程數(shù)，以評估化合物可抑制神經(jīng)突向外生長的不同方式6,7。
材料
? ImageXpress Nano 自動成像系統(tǒng)，配備 CellReporterXpress 自動圖像采集和分析軟件 (Molecular Devices)
? iCell 神經(jīng)元(Cellular Dynamics International)
? Poly-d-賴氨酸預(yù)包被 384 孔板(Corning Life Sciences)
? 層粘連蛋白 (Sigma- Aldrich)
? 多聚甲醛 (Sigma-Aldrich)
? 胎牛血清 (Sigma-Aldrich)
? β-微管蛋白 III(TUJ-1) (BD Biosciences)

? Hoescht (ThermoFisher Scientific)
? 抗 β-微管蛋白抗體 (BD Biosciences)
? Calcein AM (ThermoFisher Scientifiic)
利用基于 iPS 細(xì)胞的神經(jīng)突生長測定法鑒定具有神經(jīng)毒性的化合物
由國際細(xì)胞動力學(xué)會 (CDI) 提供的人 iPSC衍生的神經(jīng)元 ( 即 iCell 神經(jīng)元 ) 細(xì)胞，是由有絲分裂后 GABA 活性基團和谷氨酸能神經(jīng)元組成的混合物。這些研究中使用的神經(jīng)元已經(jīng)由制造商培養(yǎng)成完全分化和純化的細(xì)胞群，并已形成對神經(jīng)元標(biāo)志物β-III 微管蛋白和 MAP28 呈陽性的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞收到時為冷凍狀態(tài)，隨后解凍并根據(jù) CDI 推薦的方案鋪板。將細(xì)胞接種在聚-d-賴氨酸預(yù)包被的 384 孔板上，并用3.3μg / mL層粘連蛋白進行處理。在化合物處理之前，每孔接種 7,500 個細(xì)胞，并在 iCell Neurons 培養(yǎng)基中生長 48 小時。這些細(xì)胞中的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)通常在接種后約24 小時開始形成，并且在培養(yǎng)至 10-12 天時開始增加復(fù)雜性。在接種后 48 小時，我們神經(jīng)突向外生長進行評估，與此同時，神經(jīng)元也可能發(fā)生神經(jīng)突萎縮。在 6種濃度范圍 ( 0.3,1.0,3.0,10.0,30.0 和 100μM ) 中一式兩份測試化合物。每個平板中包括多個 DMSO 對照 (n = 16) 和未處理的對照 (n = 16)。使用高達 0.3％ 的 DMSO來評估測定中的溶劑效應(yīng)。將細(xì)胞在 37℃和 5％ CO2下暴露于化合物下 72 小時。接著，除去培養(yǎng)基，用 4％ 多聚甲醛固定細(xì)胞 2 小時。用含有 1％ 胎牛血清和 0.01％皂苷的 PBS 中的進行透化。隨后， 將細(xì)胞與抗 β-微管蛋白 III (TUJ -1) 抗體 ( 1:100稀釋 ) 和 2 μg / mL Hoechst 的結(jié)合 AF488染料的小鼠抗人抗體孵育 3 小時。 β-微管蛋白用作神經(jīng)突向外生長的標(biāo)記物，也用于完整神經(jīng)元細(xì)胞體的計數(shù)。溫育后，用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 替換染色溶液。或者，還可以使用活細(xì)胞進行神經(jīng)毒性測定，用鈣黃綠素 AM 和 Hoechst 染料 ( 分別為 0.5 μM 和 2 μM ) 染色 30 分鐘。有關(guān)接種密度優(yōu)化的詳細(xì)信息和 384 孔格式測
定的方案在 Sirenko et al.6 中有詳細(xì)描述。
優(yōu)勢
? 使用 iPSC 衍生神經(jīng)元建立高通量 3D 神經(jīng)突向外生長測定
? 使用微流體 OrganoPlate 平臺生成更多模擬體內(nèi)結(jié)果
? 優(yōu)化高內(nèi)涵成像，評估對神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的治療效果

使用 ImageXpress Nano 自動成像系統(tǒng)的10 倍 Plan Fluor 物鏡拍攝各孔的圖像。在384 孔板中的每個孔的單個位點捕獲一個10x 圖像。10x 物鏡提供了足夠的分辨率來區(qū)分每個圖像中大量細(xì)胞 (500-1,000)的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能覆蓋表總孔面積的約 1/4。在獲取圖像之后，使用CellReporterXpress? 自動圖像采集和分析軟件完成所有圖像分析，該軟件包含用于神經(jīng)突向外生長和活力評估的圖像處理應(yīng)用模塊。作為圖像處理的示例，圖 1 表示出了來自神經(jīng)突圖像和相應(yīng)分析圖層的放大的典型圖像。圖 2 顯示來自 DMSO 處理的神經(jīng)元和化合物處理的神經(jīng)元的圖像，在其相應(yīng)結(jié)構(gòu)上有軟件追蹤的覆蓋圖層。

圖 1 ?-微管蛋白 ( 綠色 ) 染色的圖像和對照細(xì)胞的軟件分析軌跡。 將 iCell 神經(jīng)元鋪板培養(yǎng) 5 天，然后固定，并用 AF 488 結(jié)合的抗-β-微管蛋白 (TUJ-1) 抗體 (1:100) 染色。圖像由 ImageXpress Nano 系統(tǒng)使用 10x Plan Fluor 物鏡和 FITC 通道拍攝。使用 CellReporterXpress 軟件中的 Neurite Tracing 分析算法處理圖像。右側(cè)的分析圖層顯示細(xì)胞生長 ( 綠色 ) 和細(xì)胞體 ( 藍色 )。

圖 2 ?-微管蛋白 ( 綠色 ) 和 Hoechst ( 藍色 ) 的復(fù)合圖像，顯示對照細(xì)胞和用所選化合物處理的細(xì)胞的分析軌跡。 將 iCell 神經(jīng)元鋪板 48 小時，用化合物處理 72 小時，然后固定并用 Hoechst (2 μM) 和帶 AF 488 熒光的抗 TUJ-1 抗體 (1:100) 進行組合染色。圖像由 ImageXpress Nano 系統(tǒng)使用 10xPlan Fluor 物鏡進行 DAPI 和 FITC 通道拍攝。使用 CellReporterXpress 軟件中的 Neurite Tracing 分析算法處理圖像。觀察到用指定化合物處理的神經(jīng)元中破壞的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞死亡。

使用多參數(shù)圖像分析對神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性進行定量分析
我們觀察到由于化合物處理效應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)形成的劑量依賴性抑制 ( 圖 3 )。在這些實驗中獲取的圖像的定量分析包括多個參數(shù)的測定，以全方位評估培養(yǎng)的神經(jīng)元的形態(tài)特征，以及神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜程度和生長程度。具體而言，神經(jīng)突向外生長的特征在于生長的程度 ( 例如，總生長的長度或每個細(xì)胞的平均生長長度 )，神經(jīng)突過程的數(shù)量( 例如，過程的總數(shù)和每個細(xì)胞的平均過程數(shù) )，以及分支的程度。( 例如，分支的總數(shù)和每個單元的平均分支數(shù) )。在整個實驗中，細(xì)胞鋪板和神經(jīng)突向外生長均勻，因此我們可以使用每個圖像的特征 ( 分支和過程 ) 的總數(shù)進行統(tǒng)計分析。此外，定量每個圖像中 β-微管蛋白 ( TUJ-1陽性 ) 或鈣黃綠素 AM 陽性細(xì)胞體的數(shù)量以評估化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。同時還測量了每個細(xì)胞的生長長度以及每個細(xì)胞的過程和分支的數(shù)量，但由于信息冗余而未用于統(tǒng)計分析?；衔锏亩拘宰饔每梢酝ㄟ^ EC50 值 ( 對神經(jīng)突向外生長的抑制程度達到50%時的化合物濃度 ) 進行比較。EC50 值來自 4 參數(shù)曲線擬合，神經(jīng)突向外生長、分支數(shù)、過程數(shù)和活細(xì)胞體數(shù)量。圖 3 顯示了神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)總長度( 總生長 ) 和分支總數(shù)的濃度依賴曲線。這些測量可以讓我們定義有效的毒性濃度，比較化合物的潛在神經(jīng)毒性效應(yīng)，并優(yōu)先進行進一步的毒性評估。
評估劑量效應(yīng)以獲取復(fù)合參數(shù)
使用 Hill 模型評估濃度響應(yīng)曲線以得出 EC50 濃度值。表 1 中列出了不同讀數(shù)的 EC50 值。在 16 種被測化合物中，其中11 種進行處理之后導(dǎo)致神經(jīng)突向外生長減少以及分支和過程數(shù)量減少。在這 11 種化合物中，其中 6 種化合物的處理也導(dǎo)致細(xì)胞體數(shù)量減少。其他 5 種被測化合物具有相對較小的影響，因此未確定 EC50 值。抑制總分支數(shù)和總生長終點的 EC50 值表現(xiàn)出高度一致性。在較低濃度下神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的破壞與特定處理條件下的細(xì)胞毒性效應(yīng)相比差別是顯著的。因此，測量細(xì)胞體數(shù)量減少的 EC50 值通常高于用這些化合物處理時抑制神經(jīng)突向外生長的 EC50 值。

圖 3 由鬼筆環(huán)肽染色的活心肌細(xì)胞的劑量 - 反應(yīng)曲線。 通過分析由化合物處理誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架完整性的細(xì)胞毒性作用來確定細(xì)胞活力。使用 CellReporterXpress 軟件中的細(xì)胞評分分析算法對用于鬼筆環(huán)肽 ( 肌動蛋白染色為綠色 ) 染色陽性的活細(xì)胞總數(shù)進行定量。用 4 參數(shù)曲線擬合繪制濃度依賴性響應(yīng)曲線，以獲得包括在表 1 中的 EC50 值。
結(jié)論
神經(jīng)突向外生長測定是一種有效且高效的高通量篩選實驗方法，適用于評估大型化學(xué)化合物庫的神經(jīng)毒性。這種篩選能進行化合物的快速鑒定、評估和優(yōu)先排序，以評估其在人體中可能誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。該測定還可用于評估可能對神經(jīng)元發(fā)育具有神經(jīng)保護或促進作用的化合物。ImageXpress Nano 系統(tǒng)是一種有效的篩選工具，可用于進行適合于高通量篩選活動的高級表型分析。